第15章 生物化学与新生物技术

生物化学与新生物技术第一节基因组学一、基因组和基因组学的概念二、基因组图谱三、人类基因组研究

一、基因组和基因组学的概念基因组（genome）是指一个生物机体的一套完整的遗传物质，即全套基因的总称，包括决定蛋白质和核酸结构的编码区，以及并非直接决定蛋白质和核酸结构的非编码区。自从1990年启动“人类基因组计划”后，开展了对人类基因组结构的研究，随着该计划的进行，发展和建立了多种新的研究技术，借助这些技术，先后开展了对果蝇、家鼠、线虫、水稻、拟南芥、啤酒酵母等数十种动植物和微生物基因组结构的研究，于是提出了基因组学（genomics）或基因组工程（genomicengineering）的概念，它包括研究基因组结构的方法技术、各种基因组图谱的建立等。

二、基因组图谱1．基因组物理图谱2．基因组遗传图谱3．基因组表达图谱4．单核苷酸多态性图谱

1．基因组物理图谱物理图是从战略的角度研究DNA序列，它是以特异的DNA序列为标志的染色休图。标志之间的距离以物理距离如碱基对（bp）、千碱基对（kb）等表示。最粗略的物理图是染色体组型图（即染色体的细胞学区带图），最精细的物理图是核苷酸序列图。物理图谱包括序列标记位点图、限制酶图、辐射杂种细胞图等。①STS图谱序列标记位点（sequencetaggedsites,STS）图谱是以碱基对为标尺，以STS为位标所绘出的物理图。STS位标是以单拷贝DNA序列为基础发展而来的一对PCR引物，每个位标在基因组内只有一个特定的位置。依据此序列设计的引物不仅具有DNA位置特异性，而且具有PCR方法测定的方便性。利用STS位标将众多的YAC克隆依照它们在染色体上的位置排列起来，构建一个所谓克隆重叠(cotig)，构建大量的重叠群后，对YAC进行DNA测序，然后把结果串联起来得到全染色体序列。

②限制酶图谱由于DNA限制性内切酶都有特点的识别序列和切割位点，因此如果用酶所识别的特异序列作为标志在DNA长链上作图，对制定物理图谱也是很有用的。不同DNA片段用限制酶切割后可产生多种不同的图形，同一个克隆一定有相同的图形，相重叠的克隆可依据其相同部分进行重叠，是用作识别DNA的可靠标志。采用部分酶切法，一个酶切产物各DNA片段的长度即表示一个识别位点的位置，可直接得到酶切图谱。同一个YACDNA片段可以用几种限制酶分别酶解，可以测定出各DNA标志所在的DNA片段，从而测定出DNA标志间的相对距离。此法的优点之一是YACDNA不必纯化，提取酵母总DNA即可。③辐射杂种细胞图谱射线可以造成染色体断裂，当用射线照射杂种细胞（含某一单个人染色体的中国仓鼠细胞）时，染色体被断裂并随后进行了随机连接，有可能得到许多染色体新组合细胞，筛选出那些只含有单一人染色体片段的仓鼠细胞组，可以得到含有全套人类染色体片段的细胞组群，每个细胞株分别含有人染色体片段，用特定的STS可以识别特定的人类染色体片段，从而制作染色体物理图谱。此方法的优点是：可得到高分辨率的物理图谱；既适用于多态性DNA标志，也适用于非多态性标志；由于使用的是PCR技术，因而方法简单快捷。④DNA序列图在制作染色体物理图的基础上，需进一步制作DNA序列图，这是最精细的物理图。制作序列图必须进行大量DNA测序工作。现在DNA测序工作大多是在Sange：双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学修饰法的基础上发展起来的DNA大规模测序技术，这种技术是将DNA测序与计算机技术和荧光技术相结合，发明了自动测序仪。在测序过程中，一般是将较长的DNA片段打断，构建一系列随机亚克降，然后通过自动测定每个亚克隆的序列，用计算机分析以发现重叠区域，最后完成对大片段的DNA定序。现在由于采用了STS作为位标，分析序列的起始位点，大大减少了对序列重叠部分的鉴定，提高了测定效率。2．基因组遗传图谱遗传图是遗传学上早就对染色体进行研究的一种方法，遗传图上位标的位置和相互之间的距离不是以碱基对等物理距离来表示，它没有确切的物理距离，而是以连锁或重组的方法来测定，以遗传单位来表示。在遗传图的制作中，旱先曾用多态性DNA标志，即限制酶片段长度多态性，后来发展为微卫星DNA标志。

3．基因组表达图谱基因表达图或称转录图，所采用的染色体位标是基因的转录产物，即mRNA。但实际上应用更多的是cDNA，即以mRNA为模板，用逆转录酶催化产生的互补DNA，完全能够反映基因的信息。

机体的每一细胞、每一组织，在不同的发育阶段，不同的生理条件和病理状态下，其表达的基因种类及每一基因的表达程度都是各不相同的。通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的cDNA文库，大规模cDNA测序，收集cDNA序列片段，定性定量分析其mRNA群体组成，从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和表达程度，这样编制成的数据表就称为基因表达图谱。这种图谱从mRNA水平反映了细胞或组织特异性表型和表达模式，即可反映基因的功能。4．单核苷酸多态性图谱在基因组中，DNA分子上存在的单个碱基变化，包括缺失和插人，更多的是单个碱基的置换，称为单核昔酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP),SNP常引起基因功能的改变，即突变。

DNA中单个碱基的置换，包括转换和颠换。转换指一种嘌呤取代另一种嘌呤，或一种嘧啶取代另一种嘧啶；颠换则是嘌呤与嘧啶间的互换。在SNP中转换多于颠换，二者之比为2:1。

三、人类基因组研究基因组学是源于对人类基因组的研究并受其推动的。人类基因组计划（HGP,humangenomeproject）是人类科学史上最伟大的壮举之一，被誉为生命科学中的登月计划。HGP最初由美国科学家在20世纪80年代中期提出，美国于1990年正式实施，计划用15年的时间完成人类基因组DNA全部碱基对（约30亿）排列顺序的测定，并在此基础上进行人类基因的定位和分离。继后，1993年又对HGP研究内容进行了修订和补充，修订后的内容包括：人类基因组作图及序列分析，基因的鉴定、基因组研究技术的建立和创新、模式生物基因组图和测定、信息系统的建立、储存及相应软件的开发、相应产业的开发等。在国际人类基因组组织的协调和统一下，开展国际合作，由美国、英国、法国、德国、日本和中国共6个国家20个工作小组的共同努力，于2000年6月26日完成人类基因组框架，2003年4月14日宣布人类基因组序列图绘制成功。人类基因组核苷酸序列图是分子水平上最高层次、最详尽的物理图谱。

第二节蛋白质组学一、蛋白质组学的涵义二、蛋白质组研究的技术简介三、蛋白质组学的应用前景一、蛋白质组学的涵义1．蛋白质组的定义2．蛋白质组学的涵义1．蛋白质组的定义1995年WasingerVC首次将蛋白质组定义为：一个基因组编码的全部蛋白质；1997年Wilkins和Wiliams在有关蛋白质组研究的第一部专著中将其定义为：一个基因组或组织所表达的全部蛋白质；1999年《Nature》杂志将蛋白质组进一步定义为：在一个细胞的整个生命过程中由基因组表达的以及表达后修饰的全部蛋白质。由此可见，蛋白质组是包括一个细胞或组织或一个生物体的一个基因组在生命的全过程中所表达产生的所有蛋白质。由于蛋白质的种类和数量在新陈代谢中总是处于动态过程中，同一细胞在不同时期、不同生长条件（正常与异常）下，其所表达产生的蛋白质是不相同的。因此，在蛋白质组的研究中，对某种生物的蛋白质组而言，必须标明时期和条件，在什么情况下产生的，才能接近阐明在该条件下基因组的确切功能。2．蛋白质组学的涵义蛋白质组学是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成、数量及其在不同生理条件下变化规律的学科。它主要研究细胞内所有蛋白质在生命活动过程中的时空表达、蛋白质分子间的相互作用、翻译后的各种修饰等。与传统的针对单一蛋白质进行的研究相比，蛋白质组学的研究不仅在研究手段上是全新的、大规模和高通量的，而且由于一个细胞蛋白质的复杂性、多样性和可变性，对其分析分离都要相对困难得多。二、蛋白质组研究的技术简介一个完整的蛋白质组研究包括下列步骤：二、蛋白质组研究的技术简介1．双向电泳2．图像数字化分析3．质谱分析技术4．蛋白质组数据库的建立1．双向电泳①样品制备用于电泳前样品需作一系列处理，包括蛋白质的溶解、变性及还原，去除非蛋白质杂质等。在蛋白质的溶解液中通常含有去极剂（尿素）和还原剂，以解除蛋白质的二级结构，使蛋白质的不同带电状态还原为单一带电状态，这就可避免同一蛋白的多个构象在等电聚焦时出现在不同的等电点位置。还原剂是破坏蛋白质的二硫键，传统用二硫苏糖醇（DTT）或浮琉基乙醇，但这些试剂带电荷，可引起含二硫键多的蛋白丢失。因而现多采用不带电荷的三正丁基麟（TBP）加上增溶剂―硫脲，所制得样品效果较好。②双向电泳第一相等电聚焦是利用不同蛋白质等电点不同在人孔径凝胶中将蛋白质分离开。在传统的等电聚焦电泳中是用小分子两性电解质载体在胶条上形成pH梯度，当蛋白质在电场下移动至与本身等电点相同的pH值的位置时，就停止移动。由于蛋白质带电状态取决于其二级结构，因此，要达到最好的分辨率，蛋白质必须充分变性。传统的用小分子两性电解质载体所建立的pH梯度是临时性的，其稳定性有限，而且机械性能也不好，易断裂，每一次制胶的重复性难于控制。因此，在蛋白质组研究中采用了一种新技术―固相pH梯度等电聚焦（IPG），该技术是丙烯酰胺凝胶预聚合时共价引人酸碱缓冲基团，利用一种偏酸性丙烯酰胺缓冲液和一种偏碱性丙烯酰胺缓冲液根据所需pH范围按比例制得。这种胶具有机械性能好、重现性好、上样量大等特点，因而适于蛋白质组研究用。第二相SDS是利用不同蛋白质相对分子质量不同而进行的分离。当第一相电泳完成后汁G胶在SDS平衡液中还原和烷基化，将蛋白质由一相胶上转移至一相胶上，然后进行电泳。平衡液的主要作用是使第一相胶条上的蛋白质变性。SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子去污剂，在溶液中加人SDS，使蛋白质与SDS的质量比为1:1.4时，蛋白质分子带过量的负电荷，此时各蛋白质的迁移率与其相对分子质量成正比。在平衡液中除含sDs外，还必须加人尿素和还原剂，以破坏蛋白质的高级结构，烷化剂常用碘乙酰胺。③蛋白质检测电泳后胶上蛋白质的检测有多种方法，灵敏度和分辨率有一些差异。检测某种蛋白质是否存在时常用western印迹，显示蛋白质全谱时多用银染检测。目前蛋白质组研究常是两种染色法相结合：经银染分析寻找有意义点后，再加大上样量，用考马斯亮蓝染色，再作进一步质谱鉴定。

2．图像数字化分析经双向电泳分离、染色后所得图像需要经过图像扫描、计算机数字化处理，确定每个蛋白质点的等电点和相对分子质量，对蛋白质作出初步鉴定。这一套图像处理系统已有现存的软件，经过分析鉴定，即可建立蛋白质组数据库。由于Internet网上数据库的构建，不同实验室的研究结果可做对比研究，有的双向电泳分析软件可以设定直接进人联合电泳数据库。3．质谱分析技术质谱技术是样品分子经离子化后，根据不同离子间质荷比（m/z）的差异来分离并鉴定相对分子质量。应用于蛋白质组研究的质谱技术，因为鉴定分析的是蛋白质大分子，因而在离子化力法上主要采用了所谓“软电离”的力法，即样品分子电离时，保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。常用的有两种方法：电喷雾离子化（ESI）和基质辅助的激光解离子化（MALDI）。根据这两种离子化技术设计的两类质谱仪在实际应用中各有特点，效果上各有千秋，应用范围上各有侧重，难以互相取代，可以互相补充。4．蛋白质组数据库的建立经过双向电泳、质谱分析等得到一系列图谱和数据等大量信息后，最后必须建立蛋白质组数据库。目前应用最多的蛋白质组数据库包括蛋白序列数据库（如SWISS-PROT,TrEMBL）、蛋白模式数据库（Prosite）、蛋白双向电泳图谱数据库、质谱数据库、蛋白三维结构数据库（PDB,FSSP）、蛋白质翻译后修饰蛋白库（O-GLYCBASE）、基因序列数据库(Genbank,EMBL）、基因组数据库（GOB,OMIM）、代谢数据库（ENZYME）等。三、蛋白质组学的应用前景蛋白质组学最初是对应于基因组学而提出来的，针对一个基因组所表达的全部蛋白质为研究对象，逐步衍生出针对某此与特定生物学机理相关联的蛋白质组群的研究。例如，比较不同生长时期蛋白质组的差异，正常细胞与异常细胞蛋白质组的差异，细胞在用药和不用药的情况下蛋白质组的差异等，这称为比较蛋白质组学或功能蛋白质组学。研究正常与疾病状态下某一组织的蛋白质组，称为疾病蛋白质组学，已进行了多项研究。如发现CalgranlinB仅在肿瘤组织中表达；通过心肥大细胞与正常细胞比较，发现一些蛋白质在这两种细胞中表达量有差异；在进行性老年痴呆症患者的脑组织中，发现与神经发育有关的蛋白质snap25的表达量降低。

第三节生物信息学一、生物信息学的涵义二、生物信息学的基本研究方法三、生物信息学的主要研究内容一、生物信息学的涵义人类基因组计划的完成，后基因组计划及蛋白质组计划的实施，出现和积累了与日俱增的信息，生命科学将全面进人信息提取和数据处理的全新阶段。早在20世纪80年代末，在美国工作的马来西亚华人林华安博士就认识到将计算机科学与生物学结合起来的重要意义，并首次提出了“生物信息学(bioinformatics)”的概念，并因此而获得“生物信息学之父”的美誉。二、生物信息学的基本研究方法1．生物学数据库的建立

生物学数据库的建立一般由专门的机构来完成。这些机构包括一些国家支持的非盈利性机构和一些知名大学的研究机构。有的实验室为了研究工作的需要也可建立一些小型的数据库。数据库可分为一级数据库和二级数据库，一级数据库的数据直接来源于实验获得的原始数据，只经过简单的归类整理和分析；二级数据库是在一级数据库、实验数据和理论分析的基础上针对特定目标而建立的。目前，世界著名的三人核心数据库是PDB生物大分子结构数据库、SWISS-PROT蛋白质序列数据库和GenBank核酸序列数据库。2．数据的检索

在研究中根据不同的实际需要，检索不同的数据库。如查找DNA序列即选择核酸序列数据库，查找蛋白质序列则选择蛋白质序列数据库等。生物学数据库的检索包括收集和筛选两个方面，根据研究者的实际需要而加以应用。3．数据的处理

无论是实验中产生的数据，还是在数据检索中查得的数据都要经过处理，一般先是对数据进行格式编辑，然后对大量的数据进行分类和整理。为了使用的方便，根据需要也可建立一个自己的小型数据库，以便于使用。4．数据的利用

对生物学数据的利用就是使用各种统计模型和算法，以便对数据进行分析。如核酸和蛋白质序列相似性比对分析、蛋白质空间结构比对分析、不同发育阶段比对分析，正常与异常比对分析、生物进化分析等。从这些分析研究中得出结果、疑问，为下一步研究提供参数等。三、生物信息学的主要研究内容1．基因组测序的信息分析2．用于发现新基因3．非编码区结构与功能研究4．生物进化的研究5．比较基因组学研究6．基因功能的研究7．大分子结构模拟与药物设计8．遗传疾病的研究

1．基因组测序的信息分析无论人或模式生物的基因组研究，都涉及大规模的测序，它的每一步都与信息分析紧密相关。在对一个基因组的测序中，首先必须将基因组打碎，再对每一个小片段测序，然后把它们重新拼接起来。如果将这些片段拼接成完整的DNA序列是测序研究中的一个难点，尤其是重复序列，在人基因组中有大约30％的重复序列，这就更增加了难度。在这种情况下借助生物信息学就显得更重要了。生物信息学提供了自动而高速地拼接序列的算法，根据数据库和相关软件提供的信息进行计算即可得出结果。不过，这个工作需要高性能计算机的大规模并行运算，因此，实际上只有一些测序中心拥有这种计算能力。2．用于发现新基因在基因组研究中，大部分新基因是靠理论方法预测出来的。例如酿酒酵母完整基因组（约1300万碱基对）所包含的6000多个基因，大约60％是通过信息分析得到的。用理论方法预测基因使用的序列数据主要来自EST序列数据库和基因组测序数据库。目前，用生物信息学寻找新基因的方法有以下两种。①通过计算分析，从表达序列标志（EST）序列库中拼接得到完整的新基因编码区。由于ESf是随机产生的，所以属于同一基因的很多EST序列间必然有大量重复小片段，利用这些小片段作为标志，就可以把不同的EST序列连起来，直到获得全长基因。②通过计算机分析，从基因组DNA序列中确定新编码区。这主要是根据编码区与非编码区的特点，将二者进行区别而鉴定新基因。有两种方法，一种是基于编码区所具有的独特信号，如起始密码子、终止密码子等；另一种是基于编码区的碱基组成与非编码区的差异。现已有许多有效算法和软件用于识别编码区。3．非编码区结构与功能研究从高等和低等生物的基因组比较发现，从生物进化、生物体功能的完善和复杂化，基因组的非编码序列明显增加的趋势提示，这部分序列必定有重要的生物功能。在细菌中非编码区序列占整个基因组序列的10-20%，而人的基因组中约占95-97％。至今已知，这些序列包括内含子、卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA、短散布重复兀件（shortin-terspersedelements,SINE）、长散布重复元件（longinterspersedelements,LINE）、伪基因（pseudogenes）等。如果把不同成分的序列分别搜集起来，建立专门的数据库，对于了解非编码区的功能将是十分有用的。

4．生物进化的研究由于基因组是物种所有遗传信息的储藏库，从根本上决定着物种的发育和生理，因此，不同物种的基因组总是存在差异，用生物信息学研究比较不同物种的核酸和蛋白质的序列差异，在一定程度上可反映物种的进化。基于此，当前生物进化在分子水平的研究（称为分子进化）已建立了一套依赖于核酸和蛋白质序列信息的理论方法，包括序列相似比较、序列同源性分析、构建系统进化树和稳定性检测等。在生物进化的研究中，相似性(similarity)和同源性（homology）是两个不同的概念。相似性只反映两类类似，并不包含任何与进化相关的暗示。同源性则是与共同祖先相关的相似性。相似性研究是将待研究序列与DNA序列库或蛋白质序列库比较，用于确定该序列的生物种属，用的力法是两两序列比较算法；同源性研究是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其他序列间的同源性大小。5．比较基因组学研究随着基因组序列