第七章 微生物的遗传变异和育种

第七章

微生物的遗传变异和育种第一节遗传变异的物质基础第二节基因突变和诱变育种第三节基因重组和杂交育种第四节基因工程第五节菌种的衰退、复壮与保藏遗传和变异遗传：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能。变异：生物体的遗传物质结构和数量的改变，在群体中以极低的几率（10-5~10-6）出现，性状变化幅度大；新性状稳定、可遗传。基本概念遗传型（genotype）：一个生物体所含有的基因的总和。表型（phenotype）：一个生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。饰变（modification）：指生物体由于非遗传因素引起的表型改变，变化发生在转录、转译水平，特点是几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化，性状变化的幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。举例：Serratiamarcescens(粘质沙雷氏菌）的红色素在25℃和37℃的变化。表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为表型饰变Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens.

Fromlefttoright:slantculturegrownat25℃,slantculturegrownat37℃,brothculturegrownat25℃,brothculturegrownat37℃.

种质连续理论：1883~1889年间德国学者Weissmann提出，认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物，具有稳定性和连续性。基因学说：二十世纪初发现了染色体并提出基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，其活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）充分证明了DNA是遗传物质。第一节遗传变异的物质基础一、证明DNA是遗传物质

的三个经典实验

（一）经典转化实验F.Griffith，1928年研究对象：Streptococcuspneumoniae（肺炎双球菌）SⅢ型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜R型菌株：SⅡ型突变菌株，无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜（2）细菌培养实验

热死S菌—————不生长

活R菌—————长出R菌

热死S菌+活R菌—————长出大量R菌和10-6S菌（3）S型菌的无细胞抽提液试验

活R菌+S菌无细胞抽提液—长出大量R菌和少量S菌（1）动物实验

对小鼠注射活R菌或死S菌————小鼠存活

对小鼠注射活S菌————小鼠死亡

对小鼠注射活R菌和热死S菌——小鼠死亡 抽取心血分离活的S菌Griffith

转化试验示意混合培养RII型活菌SIII型活菌SIII型热死菌RII型活菌SIII型活菌健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状。1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验实验证明，只有S型细菌的DNA才能将S.Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子DNA。（二）噬菌体感染实验A.D.Hershey和M.Chase，1952年实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。（三）植物病毒的重建实验为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。实验证明，遗传信息的流向与DNA的传递是一致的。上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式（一）遗传物质在7个水平上的形式1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的真核生物细胞核核染色体原核生物核区DNA链核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质2、细胞核水平遗传物质类型核基因组核外染色体真核生物原核生物细胞质基因共生生物2um质粒线粒体叶绿体等F因子R因子Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒3、染色体水平染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构染色体的数目在不同的生物中是不同的染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。DNA就是脱氧核糖核酸（长链）腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）ATCGAAATTTTTTAAAGGGGGCCCCCGC基因测序就是读出A-C-T-G-T-G-A-A-C-G…...5、基因水平基因是什么？基因是生物体内具有自主复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一段核酸序列。众多基因构成染色体。基因记录和传递遗传信息。基因决定生物体的生、长、病、老、死等一切生命现象染色体基因Ⅱ基因ⅠDNA基因控制Pr因而控制性状GATCTAGAUDNAmRNA天冬氨酸

大肠杆菌基因组4100个基因，4.7×106bp遗传信息的连续性功能相关的结构基因组成操纵子结构基因单拷贝及rRNA多拷贝基因的重复序列少而短原核生物基因调控系统操纵子RPO结构基因

启动基因操纵基因调节基因6、密码子水平遗传密码密码子7、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位几个重要数据bp,分子量约650；1*106的dsDNA约为1.5kb或0.5um;3nmol的碱基重量约为1ug.细菌的基因组为1~9个Mb。（三）原核生物的质粒1、定义和特点质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，通常以共价闭合环状(covalentlyclosedcircle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；细菌质粒多在10kb以内）主要存在于各种微生物细胞中。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。质粒与核染色体的复制可以不同步；在某些条件下能够消除；有些质粒可以在不同菌株之间转移；有些可以整合核染色体，称为附加体；另外，质粒还有重组的功能。2、质粒在基因工程中的应用（1）体积小，易分离和操作（2）环状，稳定（3）独立复制（4）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选E.coli的pBR322质粒是一个常用的克隆载体3、质粒的分离与检测

质粒的分离一般包括细胞的裂解，蛋白质和RNA的去除，以及设法使质粒DNA和基因组DNA分离等步骤。

超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；

对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。提取所有胞内DNA后电镜观察；4、质粒的主要种类质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应致育因子（Fertilityfactor，F因子）抗性因子（Resistancefactor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒（virulenceplasmid）代谢质粒（Metabolicplasmid）隐秘质粒（crypticplasmid）（1）致育因子(Fertilityfactor，F因子)又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体pisome)。（2）抗性因子（Resistancefactor，R因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。R质粒抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因抗性决定因子：抗性基因R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（mercuricion，mer）四环素（tetracycline，tet）链霉素(Streptomycin,Str)、磺胺(Sulfonamide,Su)、氯霉素(Chlorampenicol,Cm)、夫西地酸（fusidicacid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。（3）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种由E.coli的某些菌株所分泌的细菌蛋白，由质粒编码，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死不含Col因子的近缘的其它肠道细菌。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。细菌素结构基因涉及细菌素运输及发挥作用的蛋白质的基因和赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因（4）毒性质粒（virulenceplasmid）许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种编码肠毒素的质粒。苏云金杆菌含有编码δ内毒素(伴孢晶体中)的质粒根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子Ti质粒中的T-DNA可携带任何外源基因整合到植物基因组中，存在于根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）中。赋予宿主引起许多双子叶植物的根癌的特性。当带有Ti质粒的细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放至植物细胞中。含有复制子的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。是植物基因工程中有效的克隆载体。（5）代谢质粒（Metabolicplasmid）质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。降解质粒：如假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。（6）隐秘质粒（crypticplasmid）隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，如酵母菌的2um质粒。用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）

第二节基因突变和诱变育种一、基因突变二、突变与育种一、基因突变一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变,可遗传,自发或诱变产生。野生型（原始性状）基因突变突变型（新性状）狭义：点突变广义：基因突变和染色体畸变基因突变（一）微生物突变的主要类型选择性突变株菌落形态突变型菌体形态突变型非选择性突变株营养突变体(营养缺陷型)抗性突变体条件致死突变体抗原突变型产量突变型按突变株的表型分（二）突变率定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率为10–8是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2×108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是10–8

。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株（backmutant或reversemutant）或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。（三）基因突变的特点适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性：突变率低且稳定。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性：诱变剂可提高突变率。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突 变（forwardmutation），从突变株回到野生型的 过程则称为回复突变或回变（backmutation或 reversemutation）。（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明三个经典实验变量实验涂布实验影印实验证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。野生型（原始性状）特定环境突变型（适应环境的新性状）驯化定向诱变筛选？？？突变的原因？大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(培养前先分成50小管)(在同一个大管中作整体培养)3714435抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数变量试验涂布试验涂布敏感菌5×104个共12个平板5×104个菌落5000个细菌/菌落喷入T1保温重新涂布后喷入T1保温6个平板共353个菌落6个平板共28个菌落初始接种量：5×104

个/皿培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌.这时，每个平皿上的细胞数为：5100×5×104≈2.6×108个/皿在6个平板上，比接种时增加的细胞数为：

6×（2.6×108

5×104）=15.6×108在未涂布的平板上共发现28个突变，故突变率=28/15.6×108=1.8×108涂布试验中突变率的计算平板影印培养试验（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫妇的论文《平板影印培养法和细菌突变株的间接选择》，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。平板影印培养法，是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法：把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。据报道，用此法可把母平板上10~20%量的细菌转移到丝绒布上，并可利用这一“印章”接种8个子培养皿。因此，通过影印培养法，就可以从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变株。影印培养无药培养基含药培养基影印培养试验原始敏感菌种1、诱变及其机制2、自发突变及其机制（五）基因突变及其机制

基因突变基因突变（genemutation）简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在10-8~10-9范围内。突变的机制突变碱基置换（转换颠换）移码突变（缺失添加）畸变：缺失、添加、易位、倒位

点突变诱变自发突变1.诱变及其机制 诱变（inducedmutation):是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有不同的作用方式。(1)碱基置换（substitution）定义：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（pointmutation）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。分类：

转换（transition），即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换

颠换（transversion），即一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。ATCG双链DNA单链DNA图碱基置换的两种类型——转换（实线，对角线）和颠换（虚线，纵横线）由碱基置换引起的3种突变型转录转译对某一具体诱变剂来说，可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。①直接引起置换的诱变剂②间接引起置换的诱变剂①直接引起置换的诱变剂一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。在这些诱变剂中，除羟胺只引起G┇C→A﹕T外，其余都是可使G┇C&A﹕T发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。

碱基转换的分子机制亚硝酸可使碱基发生氧化脱氨作用，故它能使腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（H），使胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U），从而发生转换。它也可使鸟嘌呤（G）变成黄嘌呤（X），但这时不能引起转换。其中A→H而引起的转换过程分以下几个环节：①腺嘌呤经氧化脱氨后变成烯醇式次黄嘌呤（He）；②He通过自发的互变异构效应而形成Hk（酮式次黄嘌呤）；③DNA双链第一次复制，结果Hk因其在6位上含有酮基，故只能与6位上含有氨基的胞嘧啶（C）配对；④DNA双链的第二次复制，这时其中的C按常规与G配对，因而最终实现了转换。碱基的置换直接引起置换的诱变剂HNO2CNH2腺嘌呤CO次黄嘌呤(Hk)A..THe..THk..

THk..

CA..THk..

CG...

CCOH次黄嘌呤(He)②间接引起置换的诱变剂

引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）和6-氯嘌呤（6-CP）等。它们的作用是通过细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后而引起碱基置换，故是间接的。现以5-BU为例来加以说明。

5-BU是T的代谢类似物。当把某一微生物培养在含5-BU的培养液中时，细胞中有一部分新合成的DNA的T就被5-BU所取代。5-BU一般以酮式状态存在于DNA中，因而仍可正常地与A配对，这时并未发生碱基对的转换。有时5-BU会以烯醇式状态出现在DNA中，于是当DNA进行复制时，在其相对位置上出现的就是G，而不是原来的A，因而引起了碱基对从原来的A︰T变至G┇C的转换。G...

CA..BUG..

BUA..BUG..

CA..TA..TA..TA..TG...

CA..BU酮式G..BU烯醇式烯醇式酮式5-BU在以酮式或烯醇式状态存在时引起的

A︰T→G┇C的转换从上图中，还可看到5-BU的掺入引起的G┇C回复到A︰T的过程。通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。另外，也可以看到，为什么像5-BU这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用。

(2)移码突变移码突变（frame-shiftmutation）指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frameshiftmutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。

丫啶类染料，如丫啶黄、丫啶橙和α-氨基丫啶等，都是移码突变的有效诱变剂。丫啶类化合物的诱变机制至今还不很清楚。有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤–嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示正常DNA链上的三联密码子：∣ABC∣ABC∣ABC∣ABC∣ABC∣ABC∣ABC∣ABC∣第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子： ↓增添了一个碱基∣ABC∣ABC∣AB+∣CAB∣CAB∣CAB∣CAB∣CAB在第二个密码子中缺失一个碱基A后引起的变化↓缺失了一个碱基A∣ABC∣BCA∣BCA∣BCA∣BCA∣BCA∣BCA∣BCA增添一个碱基和缺失一个碱基后，其密码子又恢复正常： ↓增添了一个碱基↓缺失一个B∣ABC∣ABC∣AB+∣CAB∣CAB∣CAC∣ABC∣ABC增添三个碱基后，只引起一段密码子不正常： ↓↓↓加进了三个碱基∣ABC∣AB+∣CAB∣+CA∣B+C∣ABC∣ABC如缺失三个碱基，也只引起一段密码子不正常：↓ ↓ ↓∣ABC∣ACA∣BCA∣BAB∣CAC∣ABC∣ABC∣ABC由此可见，在DNA链上增添或缺失一、二或四、五个碱基时，均可引起移码突变，而增添或缺失三个或六个时，则不影响读码，只引起短的缺失或增添（插入）。(3)染色体畸变（chromosomalaberration）某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）——染色体畸变，包括以下两个方面：

染色体结构上的缺失（deletion）、重复（duplication）、易位（translocation）和倒位（inversion）染色体数目的变化。染色体结构上的变化染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化，如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加；又如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。倒位是指断裂下来的DNA片段旋转180°后，重新插入到原来染色体的位置上；易位则指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。染色体间畸变，则指非同源染色体间的易位。40年代B.McClintock对玉米的遗传研究而发现染色体易位，打破了基因是固定在染色体DNA上的一些不可移动的核苷酸片段的说法。有些DNA片段不但可在染色体上移动，而且还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还可从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA顺序的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。这似乎就是自然界所固有的“基因工程”。目前已把在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序称为转座因子（transposibleelement），也称作跳跃基因（jumpinggene）或可移动基因（movablegene）。（4）转座因子（transposableelement）转座因子插入（IS）序列转座子(Tn)特殊病毒（Mu噬菌体）定义：可在DNA链上改变自身位置的一段DNA序列。原核生物中的转座子类型转座的遗传效应转座因子的种类（1）插入序列（IS，insertionsequence）：特点是分子量最小（仅0.7~1.4kb），只能引起转座（transposition）效应而不含其它基因。可以在染色体、F因子等质粒上发现它们。已知的IS有5种，即IS1、IS2、IS3、IS4和IS5。E.coli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS（如IS2，IS3等），通过这些同源序列间的重组，就可使F因子插入到E.coli的核染色体组上，从而使后者成为Hfr菌株。因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS引起的突变可以回复，其原因可能是IS被切离，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。转座因子的种类（2）转座子（Tn，transposon，又称转位子，易位子）：与IS和Mu噬菌体相比，Tn的分子量是居中的（一般为2~25kb）。它含有几个至十几个基因，其中除了与转座作用有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其它基因。Tn虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但这些位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易插入。转座因子的种类（3）Mu噬菌体（即mutatorphage，诱变噬菌体）：它是E.coli的一种温和噬菌体。与必须整合到宿主染色体特定位置上的一般温和噬菌体不同，Mu噬菌体并没有一定的整合位置。与以上的IS和Tn两种转座因子相比，Mu噬菌体的分子量最大（37kb），它含有20多个基因。Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变。转座的遗传效应插入突变产生染色体畸变（复制性转座子）基因的移动和重排2、自发突变及其机制几种自发突变的可能机制背景辐射和环境因素的影响：由于一些原因不详的低剂量诱变因素的长期总和诱变效应。如各种短波辐射或高温诱变效应，以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质（在微环境中有时也可能是高浓度）的作用等。微生物自身有害代谢产物的诱变效应：过氧化氢对Neurospora有诱变作用，在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是同样的原因。氨基的互变异构效应：T和G会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现，而C和A则会以氨基式或亚氨基式两种互变异构的状态出现。环出效应：在DNA的复制过程中，某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失。自发突变是指在没有人工参与的情况下生物体自然发生的突变（六）紫外线（U.V.，ultravioletray）对DNA的损伤嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物，其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻胸腺嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少，但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。光复活机理：经紫外线照射所形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗中与光激活酶（photoreactivatingenzyme）（又称光裂合酶photolyase）结合，形成的复合物暴露在可见光（300~500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。由于在一般的微生物中都存在着光复活作用，所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射及处理照射后的菌液。1、光复活作用（photoreactivation）2、切除修复二、突变与育种（一）自发突变与育种从生产中选育定向培育优良品种（二）诱变育种诱变育种的基本环节诱变育种的原则（一）自发突变与育种从生产中选育：在生产过程中，微生物以一定频率发生自发突变。为选育优良的生产菌种创造了机会。定向培育优良品种：一般指用某一特定因素长期处理某微生物的群体（culturepopulation），同时不断地对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变株的目的。（二）诱变育种诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究之用。诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。

效价：指有效成分的浓度。1945时间1943194319431947195519711977目前发酵单位(u/ml)100250500～850～850～8000～2万～5万5～10万

从青霉素产量看诱变育种1、诱变育种的基本环节出发菌株诱变绝大多数个体死亡少数存活多数未变少数突变多数负变少数正变多数幅度小少数幅度大多数不易投产少数适宜投产可计算：存活率突变率高产率正变率投产率2、诱变育种的原则（1）选择简便有效的诱变剂（2）挑选优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬液（4）选用最适的诱变剂量（5）充分利用复合处理的协同效应（6）利用和创造形态、生理和产量间的相关指标（7）设计高效筛选方案（8）创造新型筛选方法（1）选择简便有效的诱变剂物理诱变剂：紫外线、激光；X射线、γ射线和快中子等。化学诱变剂：主要有烷化剂、碱基类似物和丫啶类化合物。拟辐射物质：有些烷化剂例如氮芥、硫芥和环氧乙烷等除了能诱发各种点突变外，还能诱发一般只有辐射才能诱发的染色体畸变，所以它们也被称为拟辐射物质。由于一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNA，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。同样，凡能引起核酸的其他功能改变的因素，一般也能引起突变。“生物化学统一性”法则人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。诱变剂的共性原则化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变Ames试验利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用利用回变检测致癌剂

——艾姆斯试验法S.t.his回变S.t.his

吸入滤纸片保温可疑“三致”试样

鼠肝匀浆（含羟化酶）阳性阴性

证明Ames试验重要性的应用实例

国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿(海豹肢畸形及“海豹胎)的出生率明显增高.生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用。反应停对人与动物的一般毒性极低，如服用14克并不使人死亡。但其可选择性地作用于胚胎，对胚胎的毒性明显大于母体，其对胎儿的致畸作用可高达50%一80%，如在妊娠第3--8周服用，其后代畸形发生率可高达100%，对人胚胎的致畸剂量为1毫克/千克。但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便（2）挑选优良的出发菌株出发菌株—用来诱变育种处理的起始菌株◆出发菌株应具备：

①对诱变剂的敏感性高；

②具有特定生产性状的能力或潜力；◆出发菌株的来源:

①自然界直接分离到的野生型菌株;

②历经生产考验的菌株;

③已经历多次育种处理的菌株.（3）制备单细胞或单孢子悬液

要求：

①菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；

②细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypiclag）;方法：

①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐温80（表面活性剂）

③用无菌脱脂棉过滤。制备：

物理诱变剂——生理盐水（0.85%NaCl)

化学诱变剂——缓冲液浓度：

细菌、放线菌108个/ml

霉菌、酵母菌106个/ml表型迟延现象丝状微生物的细胞内同时含有几个核，芽孢杆菌的营养细胞一般含有两个核质体，故某一突变无法反映在当代的表型上。只有当经过DNA的复制核细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，于是出现了不纯菌落，这就叫表型延迟（phenotypiclag）（或由于诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，也会出现表型延迟）。这也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退”的主要原因。（4）选用最适诱变剂量剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示，一般指强度与作用时间的乘积。各种诱变剂有不同的剂量表示方式，如化学诱变剂以一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂的相对剂量。最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在70～80%）合适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正变范围的剂量诱变处理方式：单一因子处理：复合因子处理：两种以上因素先后使用同时使用单一因子重复使用（5）充分利用复合处理的协同效应（6）寻找和利用形态、生理

与产量间的相关指标淀粉酶变色圈试验变色圈大的为淀粉酶高产菌落（7）设计高效率筛选方案筛选方案：实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；——因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。复筛的目的：确认符合要求的菌株；——复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。设计或采用高效筛选方案或方法一个出发菌株诱变剂处理选出200个单孢子菌菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5株第一轮第二轮五个出发菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5株40株40株40株40株40株诱变剂处理3、突变株的筛选（1）高产突变菌株的筛选（2）抗药性突变株的筛选（3）营养缺陷型突变株的筛选（4）条件抗性突变型的筛选与突变株的筛选相关的几个概念突变春日霉素产生菌的孢子悬液·（1）高产突变株的筛选

琼脂块培养法筛选春日霉素高产菌种含供试菌种（拮抗对象）的琼脂平板(2)抗药性突变株的筛选青霉素浓缩法梯度培养皿法青霉素浓缩法培养基(含青霉素)

接入敏感菌液（含抗性突变株）涂布抗青霉素菌落培养梯度培养皿法强抗性中抗性弱抗性含异烟肼接敏感菌含突变株

(3)营养缺陷型(auxotroph)的筛选★与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。如：A+;B+;营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：A-，B-原养型：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。与筛选营养缺陷型突变株有关的

三类培养基基本培养基（MM）[-]：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。完全培养基（CM）[+]：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。补充培养基（SM）[x]：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。针对特定营养缺陷型而言。营养缺陷型的筛选步骤和方法诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法生长谱法缺陷型的浓缩①抗生素法原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。方法：这种方法只适用于细菌，当把经诱变处理的大肠杆菌（含突变型和野生型）培养在含有青霉素的基本培养基中，一段时间后，将菌悬液在完全培养基上培养即可浓缩缺陷型.②菌丝过滤法筛选营养突变株基本培养基

接入微生物孢子（含营养突变株）涂布均匀后培养长出菌丝体（野生型）菌丝过滤得营养突变株①逐个检出法：缺陷型的检出：②影印接种法完全培养基影印接种基本培养基营养缺陷型③夹层培养法小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）④限量补充培养法

微量蛋白质的完全培养基上小菌落是营养缺陷型突变株生长谱法方法简便；回变和污染不影响结果测定物质可为粉末或纸片

缺陷型的鉴定：测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；第三节基因重组和杂交育种基因重组基因重组（generecombination）：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。重组是分子水平上的一个概念，而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexualhybridization）等原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。基因重组的意义基因重组是杂交育种的理论基础。杂交育种的优点：①由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，故在方向性和自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。②利用杂交育种可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象。杂交育种的缺点：杂交育种的方法较复杂，目前还没有得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。一、原核微生物的基因重组转化转导接合原生质体融合基因重组的方式（一）转化（transformation）转化或转化作用：受体菌（recipient或receptor）直接吸收了来自供体菌（donor）的DNA片段，通过交换整合到自己的基因组中，从而获得部分新的遗传型状的现象。接受了供体菌DNA的受体菌称为转化子（transformant）。范围：原核生物中，转化是一个较普遍的现象。若干放线菌和蓝细菌及少数真核微生物也有转化报道转化发生的条件两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的那些种中，其不同菌株间也不一定都可发生转化。进行转化的受体细胞必须处于感受态（competence），亦即受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。也可以采用人工的方法使细菌转变成感受态。感受态因子：一种细胞外蛋白，可与受体菌细胞表面的特异受体结合，结果激活细胞内一系列与转化有关的基因的表达，其中产生的自溶素使细胞表面的DNA结合蛋白和核酸酶裸露出来，以完成转化过程。不同细菌，每个细胞上的DNA结合位点数不同。转化因子的本质一般是DNA，经多次提纯操作后，每一转化DNA片段的分子量都小于1×107，约占细菌核染色体组的0.3%。据研究，呈质粒形式的转化因子，其转化频率最高；一般的转化因子都是线状双链DNA；也有线状单链DNA具有转化作用的报道。受体细胞能接受转化的生理状态称为感受态，只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，从出现到消失约为４０分钟(对数期的中期)感受态感受态出现原因细菌失去部分细胞壁的结果细菌在细胞表面产生某种Ｅ引起①转化过程：以S.Pneumoniae为例分为六阶段：转化过程②转化的特点：（a）对核酸酶敏感；（b）不需要活的DNA供体细胞；（c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；（d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染（transfection）。它与转化不同之处是病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌，中间也不发生任何遗传因子的交换或整合，最后也不产生具有杂种性质的转化子。④转染（transfection）（二）转导(transduction)转导：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传形状的现象。获得新遗传形状的受体细胞称为转导子（transductant）转导的种类：

完全普遍转导低频转导转导普遍转导局限转导流产普遍转导高频转导1.普遍转导（generalizedtransduction）通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。普遍性转导的三种后果：外源DNA被降解，转导失败。进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子流产转导1952年发现，在Salmonellatyphimurium(鼠伤寒沙门氏菌）中存在转导现象。在它的完全普遍性转导实验中：以其野生型菌株作为供体菌营养缺陷型菌株作为受体菌P22噬菌体作为转导媒介，对供体菌是烈性噬菌体，对受体菌是温和噬菌体。过程：供体菌正常噬菌体+完全缺陷噬菌体少量裂解物+大量受体菌遗传稳定的转导子①完全普遍转导裂解感染复数

（m.o.i，multiplicityofinfection）感染复数--由于每一宿主细胞表面的特异性受体有限，因此所能吸附的噬菌体数目也有一个限量。每一敏感细胞所能吸附的噬菌体的数量,m.o.i一般很大，可达250～360。由于超m.o.i的外源噬菌体吸附而引起的、不能产生子代噬菌体的裂解，称为自外裂解（lysisfromwithout）。②流产普遍性转导

（abortivetransduction）概念：普遍性转导中，供体染色体与受体染色体需进行两次交换，才能形成稳定的转导子。受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物——酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释，所以，能在选择性培养基平板上形成微小菌落就是流产转导的特点。2.局限性转导定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因