第10章 动物基因工程

动物基因工程（AnimalGeneticEngineering）第十章主要内容第一节目的基因的获取第二节基因体外重组第三节转基因第四节基因敲除与基因诊断第五节动物克隆技术动物基因工程，原称遗传工程，是应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，创造新生物物种，通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术；或指应用现代化的生物科学和遗传学技术，对动物基因进行操纵或改造的科学工程。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，还包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。什么是动物基因工程？基因工程一般分为4个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引人某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。基因工程的基本操作第一节目的基因获取1基因组DNA及总RNA的提取

动物DNA的来源（核DNA、线粒体DNA、质粒DNA）1.血液、毛发、皮屑（口腔上皮细胞）、精液、化石及耳朵等活体组织；2.固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化

RNA来源：新鲜组织或细胞DNA提取方法：常规苯酚-氯仿方法、试剂盒方法---；RNA提取：所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理GenomeDNATotalRNA2基因文库基因文库(Genelibrary)包括cDNA文库(cDNAlibrary)和基因组文库(Genomelibrary)。

文库:cDNA是指以mRNA为模板,经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA。RT-PCR：反转录PCR（ReverseTranscriptionPCR）cDNA文库：提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。实际为不包含内含子的基因组文库。cDNA文库(cDNAlibrary)基因组文库（GenomicDNALibrary）从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。文库构建3PCR

*PCR，即聚合酶链式反应或多聚酶链反应（PolymeraseChainReaction）,是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。

*由1985年穆里斯（K.Mullis）发明，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR的原理：体外DNA复制。包括高温变性、低温退火和中温延伸过程。PCR反应五要素

引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

TaqDNA聚合酶1）来自水生栖热菌Thermusaquaticus；2）良好的耐热性；3）Mg2+依赖性；4）无校正功能PCR反应条件优化：引物设计：PCR的类型㈠巢式PCR㈦原位PCR㈡多重PCR㈧定量PCR㈢不对称PCR㈨差异显示PCR㈣共享引物PCR㈩重组PCR㈤锚定PCR(十一)RT-PCR㈥彩色PCR

(十二)RAPD----------

多重PCR:是指在一个单一反应中同时扩增多个序列的反应过程，能够节省时间和精力。定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA

锚定PCR：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA。

基本概念巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。差别显示ＰＣＲ：是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。基本概念4基因克隆

基因克隆（gene

cloning）：或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。克隆（clone）：指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。

基因克隆步骤：1)

获得待克隆的DNA片段（基因）；2)目的基因与载体在体外连接；３)重组DNA分子导入宿主细胞；４)筛选、鉴定阳性重组子；５)重组子的扩增与／或表达。5核酸分子鉴定

1、PCR结合测序：2、核酸杂交技术（基于碱基互补配对）Southern杂交Northern杂交原位杂交序列测定Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法。*是southern于1975年创建用以鉴定DNA中某一特定的基因片段的技术，也称为Southern印迹（SouthernBlot）。*通过标记的探针DNA与靶DNA结合，检测目的基因的存在及大小。Southern杂交Northern杂交*也称为Northern印迹（NorthernBlot），用以检测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量。*因与DNA的杂交（Southern杂交）相对应，故被趣称为Northern杂交。原位杂交*细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。

*细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。Western(印迹)杂交*蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。*与DNA、RNA水平上的Southern杂交、Northern杂交相对应，称为Western杂交。*常结合Northern印迹技术，检测基因表达调控。第二节

基因体外重组技术1重组质粒构建载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。质粒是指一种存在于细胞内能独立复制的染色体外的DNA。

1)质粒图谱登记号：0052

2)质粒名称：pBudCE4.1

3)来源：Invitrogen

4)用途：真核表达载体

5)详细资料

6)是否可以共享

7)联系方式：PM

重组质粒的构建过程2重组基因的鉴定抗性筛选法：能否生长；蓝色和白色菌落，其中白色菌落可能含重组质粒。

PCR：双酶切：3体外表达*在原核生物中的表达：细菌、酵母*在真核生物细胞中的表达：人工培养肝细胞、上皮细胞人工培养的人成骨细胞人成骨细胞内的pEGFP蛋白表达

第三节

转基因技术（Transgenictechnology）1转基因与转基因动物转基因超级鼠1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2～3倍，体积大一倍。概念转基因：1）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。2）转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变。