多肽抗原的设计与抗体制备演示文稿(第二版)

多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计多肽的固相合成和纯化多肽的交联和免疫抗多肽抗体的检测和功能学鉴定抗体的纯化怎样利用Internet的免费资源寻找与抗体相关的信息

抗合成肽类抗体制备程序免疫原性肽的选择肽的合成、纯化与鉴定载体蛋白的选择连接剂的选择载体蛋白/肽连接物免疫动物McAb的制备ELISA筛选抗体血清反应性收集阳性血清Westernblot,Immunofluorescenceassay鉴定抗体的生物学功能阳性抗体的纯化抗体制备常用的免疫原

1：表达纯化一段或全长的重组的带GST,Histag的融合蛋白

Abnovacorporation

2：利用合成肽制备抗体

AVIVASYSTEMSBIOLOGYLIFESPANBIOSCIENCES

3：利用纯化的天然蛋白免疫原性肽选择的基本程序利用在线设计软件或DNAStar筛选抗原性强的多肽序列尽量使用N端或C端的序列该序列经Blast后在人的其他蛋白中同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高度保守用peptidecompanion软件判定易于合成的14-16个氨基酸免疫原性肽选择的注意事项避开信号肽，磷酸化，糖基化位点避开很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,例如zincfinger，SH2domains，GTPbindingsites。有些蛋白在成熟的过程中会切割掉一小段肽段。如果选用MBS交联方法，需要在N端或C端加上C对于有些基因来说，可能含有不止一个转录异构体（transcriptvariants），这时就要在这些转录异构体的共有序列中寻找抗原多肽

利用Swiss-Prot数据库辅助设计..\UniProtKB-Swiss-ProtentryP26992[CNTFR_HUMAN]Ciliaryneurotrophicfactorreceptoralpha.htm多肽的固相合成此法的基本过程是：基于Fmoc化学合成，将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子保护性氨基酸的羧基（已经活化）作用（用NMM,HBTU作偶联剂）形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。合成原料Fmoc-AA(prot)-Wangresin

提供肽链延伸反应的固相颗粒状介质例如：Fmoc-His(Trt)-Wangresin

Prot：Boc,tBu,Trt,OtBu侧链活性位点的保护基团

Fmoc:α-NH2保护基团：

Boc:

Trt:

Fmoc-AA(Prot)-OHSolvent1:DMFSolvent2:20%pipdine/DMFSolvent3:0.4MNMM/HBTU/DMFSolvent4:50%ACN/DMFSolvent5:methylenechlorideSolvent6:94%TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2O标准合成程序Stepsolvent/operationvolumemixtimedrainRep1DMF100:00:30on3220%pipdine/DMF100:07:00on23DMF100:00:30on64Reagent(AA)100:00:00off150.4MNMM/HBTU/DMF100:40:00on16DMF100:00:30on3标准切割程序Stepsolvent/operationvolumemixtimedrainRep1DMF100:00:30on3220%pipdine/DMF100:07:00on23DMF100:00:30on64methylenechloride100:00:30on65Dry100:10:00on16TFA202:00:00on17TFA100:00:30on18methylenechloride100:00:30on39Dry100:02:00on1

多肽合成的一般常识固相多肽合成一般最多只能合成到20aa。为了保证合成的效率和纯度，我们在设计多肽抗原时，一般设计14-16aa的多肽。减少多肽序列中多个困难性氨基酸Cys,Met,Arg,orTrp的含量。避免多肽序列中连续3到4个疏水性的氨基酸。（Val-V，Leu-L，Ile-I，Met-M，Phe-F）避免Asp-Pro序列避免多肽序列中最后一个氨基酸是Pro。PIWIL3SR0015FFLKHGSNFQNPPPCaspase2SR0024TDTVEHSLDNKDGPCaspase7SR0032DRVARHFESQSDDP切割完以后，用乙醚沉淀什么都没有多肽两端的氨基酸对多肽溶解性的影响要远大于其中间序列，因此要避免其两端有连续的两个疏水性氨基酸。

Ago2SR0009IVEHMVQHFKTQIF极难溶

DGCR8SR0004LHILSKLQEEMKRLTNFRSF19SR0303WSLRSQDIQYNGSELS不溶于甲醇可以用peptidecompanion软件辅助判定多肽合成的难易程度，但是由于该软件默认了最后四个氨基酸是容易合成的，可是有时实际情况并不如此，因此依然需要综合考虑TIE1SR00043DRPEETSTIIRGLN

BAG4：SR00079

LRRSGYGPSDGPSY

SR00007DicerGKVRVTVEVVGKGK

多肽的鉴定和纯化合成完整长度粗肽的纯度不仅取决于多肽的本身长度和序列的特异性，还和使用的各种试剂的质量密切相关，因此我们合成多肽使用的试剂都是色谱纯。Fmoc固相多肽合成每个氨基酸的偶连效率在95%以上。对于一个15aa的粗肽，其完整长度多肽的合成效率一般在50%左右。长度2345678合成效率〉%95908581777369长度〉%9101112131415合成效率〉%66625956535048长度〉%16171819202122合成效率〉%45434140373537质谱分析（MS/ESI）用途：测定合成的粗肽产物中目标肽的分子量，以此来衡量我们合成的肽序列是否正确原理：将样品分子离子化后，根据离子间不同的质荷比（m/z）来分离并确定分子量。

TPTE

SR00283:(CH3CO)RVSENKRRYTRDGFC

MW：1887.13+42=1929.13TNFRSF13BSR00306（NH2）PELRRQRSGEVENNSD

MW：1885.99多肽粗品中一般含有非全长多肽,非多肽类杂质。非多肽类杂质主要是指去保护过程中产生的一些保护性基团，多肽裂解过程中的一些原料如DTT、TFA等。粗肽的一般后期纯化处理有脱盐，离子交换色谱，反相HPLC。国内外的多肽公司可以根据用户要求的纯度选择不同的纯化方法。多肽的纯度分析一般使用反相HPLC，通常都能得到较好的分析效果。多肽脱盐（凝胶过滤法）

原理：利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法。

表葡聚糖凝胶(Sephadex)的物理特性品名干胶颗粒直径/μm得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量／Da线性葡聚糖分子质量/Da20℃lOO℃SephadexG-1O40-1201.0±0.12-370070031>9810(100)SephadexG-1540-1201.5±0.22.5-3.51500150031>9810(100)SephadexG-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.5±0.24-61000-5000100-500062>9810(100)SephadexG-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.0±0.39-111500-30000500-1000062>9810(100)SephadexG-75中粗超细40-12010-407.5±0.512-153000-700001000-500002434905(50)SephdexG-100中粗超细40-12010-4010±l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)SephadexG-150中粗超细40-12010-4015±1.520-305000-4000001000-1500007251472(15)SephadexG-200中粗超细40-12010-4020±2.030-405000-8000001000-200000725981(10)多肽脱盐条件选择SephdexG-15:适用于分子量在1500-2000多肽的脱盐，对于分子量超过1500的多肽能够完全排阻。柱子的选择：鼎国自产10mm×20cm色谱柱柱床体积：根据上样体积确定，一般柱床的体积不要少于上样体积的10%。我们一般脱盐1.0ml的多肽，柱床体积通常选者10-15ml。洗脱速度：洗脱速度会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。流速通常选择1ml/min洗脱夜:PBS，0.1MNaHCO3-0.5MNaCl(PH8.3)

检测波长：214nmSR0002脱盐结果称取SR0002约7.0mg,溶于1.0ml的0.1MNaHCO3-0.5MNaCl(PH8.3)过柱收集：500ul/管OD214(空白）=0.664(1)OD214=0.704(7)OD214=0.869(2)OD214=0.713(8)OD214=1.095(3)OD214=0.710(9)OD214=0.909(4)OD214=0.718(10)OD214=0.780(5)OD214=0.724(11)OD214=0.661(6)OD214=0.742(12)OD214=0.598峰形区带变宽，收集第（6），（7），（8），（9），（10）管共约2.5ml，会有部分损失。多肽RL-HPLC分析RL-HPLC是一种分辨率最高的分离分析方法，可以分开长度上相差一个氨基酸的多肽。流动相中溶质分子与固定相配基间的疏水性相互作用形成的“on-off”机制。RL-HPLC分离多肽的基础是待分离多肽间“疏水脚”的细微差别，这些差别来源于氨基酸序列和构象的差异。SR0001多肽的RL-HPLC分析色谱柱：瑞典进口填料KroamsilC18柱

250*4.6mm,5um,120A(<2,000MW)

分析程序：洗脱液A(弱移动相）:500ml0.1%TFAinH2O

洗脱液B(强移动相）:500ml0.09%TFAin60%acetonitrile/40%H2O（V/V)

样品溶解：0.25mgSR0001溶于80ulA液中，加入不超过总体积25%的B液（即20ul)助溶。取80ul加入4ml的水稀释，上样20ul/1ug。

LinearABgradientEluentA:0.1%TFAinH2O

EluentB:0.09%TFAin80%acetonitrile/40%H2O（V/V)Gradientrangeandtime:95%-0%Ain90mins5%-100%Bin90minsFlowrate:0.8-1.0ml/minsGradientrate:1%B/minsDetection:214nmTemperature:25℃

SR00001RL-HPLC分析结果

如果我们独立的看这一张色谱峰形图，我们并不能确定这个主峰就是代表合成的完整的多肽，需要联合进行质谱分析其分子量，从而最终确定该峰是否代表合成的完整的多肽。对于合成的18个aa以下的多肽，通过RL-HPLC分析通常都能得到单一的主峰。因为在我们的合成程序中并没有引入别的反应程序，而且每步反应的效率都在95%以上，因此根据经验我们就可以认为该主峰就是代表我们合成的完整多肽。根据实验目的来确定多肽是否需要纯化或者纯化到什么级别，免疫级别的多肽一般纯度达到70%就可以了。多肽的溶解和保存多数肽易溶于无菌的PBS对于碱性肽来说（K,R,H),如果一开始用PBS不溶解，用10%或更高浓度的乙酸溶解。如果肽仍然不溶解，加入<1/20体积的TFA溶解对于酸性肽来说（D,E),如果一开始用PBS不溶解，加入<1/20体积的稀氨水溶解对于极疏水的肽用10%的乙腈或甲醇溶解仍然不溶的极个别肽试着用DMF，盐酸胍来溶解。但是我们一般还是首选甲醇而要避开乙腈（CH3-CDMF（---N),CH3CH3NC//OH）小技巧：多肽的溶解具有“全或无”的特性，当发现某个多肽两端有连续两到三个疏水性氨基酸时，这样的多肽可能就是不好溶的，我们可以先称1-2mg的多肽试溶于PBS，如果比较好溶的话，那么7-8个mg的多肽溶解也不成问题。如果不溶于PBS的话，就称取1-2mg的多肽试溶于有机溶剂。这样做的目的就是不要浪费多肽。多肽的保存所有多肽均以粉末状保存于-40度，在这一条件下，多数肽可以保存几年。禁止将合成的肽都溶解以后分装保存，提倡用多少取多少。溶液肽远比冻干形式不稳定，溶液应为中性pH(pH5-7),-20℃保存的，为避免样品的反复冻融，最好分成小样存放。一份样品融冻后未用完，应扔掉。多肽偶联合成的多肽分子量较小，免疫原性较差。故常需与载体蛋白交联以增强其免疫原性。偶联是一种基于化学偶联剂的化学反应，大多数依赖于游离的氨基，巯基，酚基，羧基的存在。游离氨基：多肽N端的第一个氨基酸（α-NH2)，K游离巯基:C游离酚基：Y游离羧基：多肽C端的第一个氨基酸（α-COOH),D,E载体蛋白选择KLH：MW>2000KD6.9ε-NH2，1.7-SH，7.0酚基BSA:MW67KD59ε-NH2，1-SH，19酚基

OVA:MW43KD20ε-NH2，4-SH，10酚基

肌红蛋白：

MW17KD19ε-NH2，0-SH，3酚基绝大多数国外的抗体公司用KLH作为载体蛋白。交联方法MBS法戊二醛法EDC法MBSCoupling

EDCmethod以上的四种交联方法中，最常用的还是前三种，但是戊二醛法，EDC法，都有一定程度的二次反应。偶联剂修饰的氨基酸初次反应二次反应MBSCys-SH戊二醛Ε-NH2Lys，α-NH2，SH-CysTyr，HisEDCΕ-NH2Lys，α-NH2，α-COOH，Glu，AspTyr，Cys不同的肽序列应该选择不同的偶联方法。偶联是一定要发生在多肽的末端，避免偶联发生在多肽的中间序列。N-端序列需要通过C-端氨基酸偶联，而C-端序列则需要通过N-端氨基酸偶联。CLIC1（241aa)SR00239(147-160aa):

PLPEEVDETSAEDE

（NH）BSA（NH）PLPEEVDETSAEDEKK(NH)（NH）PLPEEVDETSAEDE(NH)（NH）PLPEEVDETSAEDEK(NH)（NH）PLPEEVDETSAEDEK(NH)（NH）PLPEEVDETSAEDE典型的错误偶联方式CLIC1（241aa)SR00240（46-59aa):VDTKRRTETVQKLBSAK(NH)VDTKRRTETVQKL(HN）K(NH)(HN)VDTKRRTETVQKLK(NH）（HN）VDTKRRTETVQKLK（NH）(HN)VDTKRRTETVQKL赖氨酸(K）含有游离的ε-氨基，他也可以通过戊二醛与载体分子上的氨基以共价键结合，可能会影响多肽链上赖氨酸及其附近氨基酸残基暴露的侧链的免疫原性或者产生的抗体不是针对天然蛋白中的多肽的确切结构。K(NH)(HN)正确的偶联方式在其C端加上一个C，用MBS法CLIC1（241aa)SR00240（46-59aa):VDTKRRTETVQKLCBSAK（NH）(HS)VDTKRRTETVQKLCK（NH）(HS)VDTKRRTETVQKLCK（NH）VDTKRRTETVQKLC（SH)K(NH)VDTKRRTETVQKLC(SH)K(NH)VDTKRRTETVQKLC(SH)来源于蛋白中间序列多肽的偶联可以发生在N端，也可以发生在C端，但是我们一般会选择偶联在免疫原性相对较弱的一端。有的公司提到：来源于蛋白中间序列的多肽，为了最大程度的模拟其在天然蛋白中的位置，其N端常乙酰化，C端酰氨化。有的公司则认为没有必要，而且这样做常常会增加多肽的疏水性，导致溶解度减小。LocationinthenativeproteinN-terminusinternalC-terminusIsthereaCinsequenceAddaCtoc-terminus(MBS)RedesignsequenceChoosewhichterminalisconjugatedN-terminalconjugationIsthereaKinsequence戊二醛AddaCtoN-terminalRedesignsequenceIsthereaCinsequenceAddaCtoN-terminalRedesignsequenceIsthereaCinsequenceRedesignsequenceAddaCtoC-terminalConjugationChemistryDeterminationFlowDiagramnoyesC-terminalconjugation

IsthereaCinsequencenoyesnoyesyesnoyesnomadebypuyong2006.5.27肽与载体蛋白偶联结果观察连接物中多肽与载体蛋白的分子比影响其诱导免疫应答的效应。分子比太低，常常引起无关的免疫应答；分子比过高，易诱导低特异性抗体的产生。最适合分子比为：一个BSA分子与5-15个半抗原分子结合。我们交联后的肽-载体蛋白复合物，理论上平均一个BSA分子上面交联了20个多肽分子。肽与载体蛋白的偶联反应是一种比较稳定和充分的化学反应，戊二醛的偶联效率通常能达到80%以上，MBS的偶联效率通常能达到90%以上。因此，很多公司认为没有必要进行这一步的检测。我们对偶联结果通过SDS做了定性检测。偶联结果：SDS胶考马斯亮蓝染色MBS偶联多肽免疫免疫动物：健康新西兰大白兔1只饲养条件：