水解酶促脱腐产腐水剂的研究

水解酶促脱腐产腐水剂的研究

它也被称为芥末、黄瓜、霉菌豆腐、长毛豆腐和乳腐。它是中国的豆制酸生产产品。发酵成熟的腐乳具有营养丰富,质构细腻柔滑,滋味鲜美和诱人食欲的特点,是人们喜爱的开胃佐餐食品和调味品,在众多的豆制品中占有十分重要的位置。腐乳后酵过程,微生物所分泌的酶对蛋白质进行降解,不仅使其转化成更有利于吸收的氨基酸和肽类,氨基酸含量得到很大程度的提高,且使其具有独特的风味和质构。传统腐乳生产过程中,毛霉菌种选育的繁杂,加之腐乳的后酵是一个漫长而复杂的过程,是蛋白质降解,形成腐乳特有风味的主要阶段,后熟期一般为2~6个月,甚至更长,因此半成品占用空间大,给扩大生产规模带来困难,腐乳生产周期冗长,容易受污染。因此,本工作目的在于研究促熟腐乳工艺的可行性,以豆浆为原料,采用酶制剂Ⅰ和酶制剂Ⅱ促熟腐乳,通过单因素和响应面实验,系统地分析制备酶促腐乳的最佳酶解条件,为生产酶促腐乳提供了一定的理论依据。1材料和方法1.1corelegns菌株的鉴定大豆天津市利民调料有限公司,并保存于实验室常温干燥环境下;酶制剂Ⅰ、酶制剂Ⅱ帝斯曼(中国)有限公司;雅致放射毛霉Actinomucorelegans菌株(文中简称毛霉)本实验室保藏;H2SO4(分析纯)耀华化工厂;K2SO4(分析纯)天津市塘沽兴华化工厂;CuSO4(分析纯)北京化学试剂公司;NaOH(分析纯)北方天医化学试剂厂;甲醛(分析纯)中国医药上海化学试剂公司。电热恒温培养箱天津市中环实验电炉有限公司;电子分析天平上海精密科学仪器有限公司;微量凯氏定氮仪广州尚准仪器有限公司;自制腐乳压榨模具。1.2实验方法1.2.1b/t1160-2007蛋白质含量、氨基酸态氮的测定参照SB/T10170-2007。水解度(DH):水解度以水解液中总氨基酸态氮量与总氨量的百分比表示(%)。1.2.2酶促进腐败生产大豆→浸泡→磨浆、煮浆→冷却→凝乳→划块、排水→压榨成形→接种毛霉→毛坯→密闭水解→灭酶→后酵→酶促腐乳。1.2.3不同因素对水解度的影响单因素试验研究了酶制剂Ⅰ和酶制剂Ⅱ在不同底物浓度、酶解时间、酶解温度、加酶量及其复配对酶解效果的影响。按以上5个因素的不同设定条件进行水解度测定。在单因素试验的基础上,根据正交试验的中心组合实验设计原理,进行L9(34)正交试验设计,见表1。以水解度为考察指标,确定两种酶水解腐乳的最佳条件,选择最佳的酶解工艺条件。2结果与讨论2.1单酶酶解的工艺2.1.1底物浓度对两种酶水解度的影响在酶解温度为50℃,加酶量0.01%,酶解时间4h下,研究底物浓度为4%,5%,6%,7%,8%时水解度,结果见图1。由图1可知,底物浓度较低时,二种酶均随着底物浓度的升高,水解度上升,且都在6.0%的时候达到最大值,底物浓度继续升高,则水解度下降。这主要是因为在低浓度的时候,溶质的流动性好,酶与底物的结合充分,水解度逐渐上升;随着底物浓度的升高,溶质的流动性变差,酶与底物的结合不充分,底物与酶结合量减少,限制了反应的进行,从而引起水解度的降低。因此选择底物浓度为6.0%作为最佳底物浓度。2.1.2温度和温度对dh的影响配制底物浓度(固形物含量)为6.0%的豆浆,酶浓度为0.01%,酶解时间为4h,分别控制温度为40,45,50,55,60℃,结果见图2。由图2可知,40~50℃时,DH呈上升趋势;当温度高于50℃时,DH呈下降趋势。这是由于适当的加热可使酶活性达到最佳状态,同时也使蛋白质结构疏松,暴露出更多的酶作用位点:但当温度过高时,酶蛋白部分变性,反应速度下降,因此50℃为该体系的最适水解温度。2.1.3水解度结果分析在酶解温度为50℃,加酶量0.01%,底物浓度(固形物含量)为6.0%时,研究酶解时间2,3,4,5,6h时的水解度,结果见图3。由图3可知,酶制剂Ⅰ和酶制剂Ⅱ都随反应时间的延长,DH值呈上升趋势,在4h以后变化趋于平缓,水解4h与水解6h水解度相差不大。这是由于在水解初期,底物浓度较高,对酶反应的抑制作用小,随着时间的延长,产物的反馈抑制作用逐渐增强,酶促反应速度逐渐降低,最终达到平衡。因此综合考虑成本问题,4h为最佳酶解时间。2.1.4酶制剂用量对水解度的影响配制底物浓度为6.0%的豆浆,控制温度为50℃,分别按0.005%,0.01%,0.015%,0.02%,0.025%(豆浆)添加不同量的酶制剂,水解4h后测定水解度(DH),结果见图4。由图4可知,水解度(DH)随着酶用量的增加有略微的降低,可能是因为当酶制剂浓度过了峰值,酶促反应受底物浓度的反馈抑制,导致反应速率下降。因此,酶浓度为选取0.01%作为该体系的最适添加量。2.1.5复合酶制剂对水解度的影响由于每一种酶具有专一的特异性酶切位点,当这类位点全部断裂以后,即使酶没有完全失活,或者继续加入酶,水解度都难以提高。因此,为了进一步提高腐乳的水解度,可以利用不同酶制剂的特异性催化位点的不同,采用复合酶制剂水解的方法,增加酶制剂的特异性催化位点,从而达到提高水解度的目的。为了节约成本,结合酶制剂Ⅰ和酶制剂Ⅱ单因素的最佳酶解条件,实验中保持酶总量0.01%不变,在底物浓度为6.0%,水解温度为50℃,酶解时间4h,以酶制剂Ⅰ∶Ⅱ为9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7,2∶8,1∶9配制复合酶制剂加入到豆浆中,研究水解度变化,结果见图5。由图5可知,使用复合酶制剂水解腐乳时,水解度有明显提高,高于单一酶制剂水解腐乳的水解度。其中当复合酶制剂比例为3∶7时,水解度明显高于其他组。因此,选择酶制剂Ⅰ∶Ⅱ复合比为3∶7作为复合酶制剂最佳配比。2.2酶解最佳条件的确定为获得复合酶制剂水解最佳工艺参数,在单因素试验的基础上,确定酶制剂总浓度为0.01%,酶制剂Ⅰ∶Ⅱ比例为3∶7,以底物浓度、酶解时间、水解温度3个因素为自变量,以水解度为指标,设计L9(34)正交试验来确定酶解的最佳条件。其实验方案与结果见表2,方差分析见表3。由表2可知,3个因素对水解度影响大小顺序依次为C>B>A,即酶解时间>酶解温度>底物浓度。由表3可知,酶解时间对水解度的影响显著,底物浓度和酶解温度对水解度的影响均不显著。理论最佳工艺条件为A2B2C3,即底物浓度6.0%,酶解温度50℃,水解时间为5h。2.3不同温度和时间对酶促乳酸水解度的影响实际操作中将正交分析法优化的酶解工艺条件适当调整为底物浓度6.0%,酶解温度50℃,水解时间为5h,在此条件下得到酶促腐乳的水解度为26.53%,正交试验结果最高的水解度为25.56%,基本吻合,这表明该酶解工艺较为理想。3酶制剂促熟乳酸工艺验证本文使用