腺病毒载体研究进展

腺病毒载体研究进展

20世纪80年代末，基因治疗作为一种新兴的医疗手段出现了。1990年,第一个基因治疗方案在美国被批准进入临床观察。到目前为止,在全世界范围内已有上千个基因治疗方案进入临床观察。基因治疗特别是在疑难疾病的治疗方面显示出巨大的应用潜力,为人类疾病治疗开辟了一条新的途径。目前的基因治疗载体主要分为病毒载体和非病毒载体。非病毒载体安全但低效,病毒载体经过改造后保留对机体细胞的感染能力,但不具有致病性,使用相对安全,且感染效率高。应用较多的病毒载体有反转录病毒(包括HIV)载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体和甲病毒载体等。由于腺病毒载体具有许多独特的优点,是目前应用最为广泛的一种病毒载体。本文就腺病毒载体的研究进展作一综述。1.苏氏原螯虾traft腺病毒是一种线性无包膜的双链DNA病毒,病毒颗粒直径约60~90nm,呈20面体立体对称。病毒衣壳有252个壳粒,规则排列成240个六邻体(Hexon,每面12个)和12个五邻体(Penton)单位,其中五邻体位于顶角处,从每个顶角壳粒的基底伸出一根纤毛突起(Fiberprotruding),其末端具有一个结节区(Knobdomain)。因此腺病毒的衣壳结构可以分为五邻体和六邻体两部分,其中五邻体又由五邻体基底部(Pentonbase)、纤毛突起和结节区组成。腺病毒的基因组约为36000bp,基因组两端各有长100~150bp的末端反向重复序列(Invertedterminalrepeatssequence,ITRs),在其左端ITRs3′端为长约300bp的包装信号(Ψ),它们是腺病毒复制包装所必需的顺式作用元件。根据病毒DNA复制前后顺序,可将基因分为早期和后期转录单元,早期基因可分为E1a、E1b、E2a、E2b、E3和E4,编码病毒的调节蛋白;后期基因由L1~L5组成,编码病毒的结构蛋白。野生型腺病毒可感染人体多种组织细胞,并在细胞内复制,产生大量子代病毒。目前用于基因治疗的多为人类的2型和5型腺病毒,其感染细胞的过程是从纤毛的结节区黏附到细胞表面的与柯萨奇B病毒共用的一种受体——柯萨奇/腺病毒受体(Coxsackieadenovirusreceptor,CAR)开始的。随后病毒五邻体基底部的精-甘-天门冬氨酸三肽(RGD)与细胞表面的αυβ3和αυβ5整合素结合,通过内吞作用将腺病毒内化到细胞中。进入细胞后,外包装壳蛋白解体,使病毒粒子进入细胞质,然后转位到细胞核,通过核孔将病毒DNA释放到细胞核内。病毒基因组进入细胞核后,再经过一系列剪切和转录过程,最终包装成新的病毒颗粒。2.病毒防护装备的分类现有的腺病毒载体可根据病毒基因的置换程度,分为第一、第二和第三代。2.1第二,5型腺病毒可组成性诱导的实际细胞的复制第一代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和/或E3两个区而获得的。E1基因为病毒复制必需区,其缺失使腺病毒载体成为复制缺陷型。E3基因是病毒复制非必需区,可用作外源基因插入区。由于E1基因的缺失,造成病毒复制的缺陷,使其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的293细胞中完成。第一代腺病毒载体宿主范围广,感染率高,容易制备高滴度病毒,稳定、高效率转导目的基因,致病性低,不整合入细胞基因组,不但可以转染分裂期细胞,而且可以转染静止期细胞,但也存在许多不足之处:①载体的包装容量有限,最多仅能转导8000bp的外源基因片段;②外源基因表达时间短,表达水平低;③免疫原性强,使重复感染失效;④病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列,通过重组,可重新获得E1区,出现复制型腺病毒。2.2第二代载体el蛋白基于第一代腺病毒载体的以上缺点,人们对其进行了不断的改进,进一步去除病毒基因,提高载体容量,减弱病毒蛋白所致的细胞免疫反应。1994年,Engelhardt等将E1区缺失的病毒E2a基因发生点突变,构建一个含lacZ的重组载体,使E2a基因产物DBP(DNA结合蛋白)具有温度敏感性,在40.5℃时可阻断晚期基因表达,使病毒不能复制。动物实验表明这种载体引起宿主炎症反应的作用比早期载体弱,导入标志基因产物(β-半乳糖苷酶)表达时间略有延长。进一步改建的第二代载体,使病毒基因组产生了更多的缺失,使载体的装载能力更大,允许插入最大约14000bp的外源序列,并进一步降低了病毒蛋白的表达。引起的宿主抗病毒免疫反应与第一代载体相比要弱很多,细胞毒性也有所减弱。同时,为了避免复制型腺病毒的产生,人们利用其他的容许细胞系(如PER.C6,能表达El蛋白,但与载体不存在同源序列)代替293细胞。第二代腺病毒载体的改进取得了一些成果,但还存在一些问题,如基因转移和表达时间没有明显延长,且病毒载体滴度很低,只有第一代的1/1000~1/10。2.3辅助腺病毒载体的制备和复配随着对腺病毒分子结构的深入研究,发现除了腺病毒两端长约500bp的顺式结构是其复制和包装所必需外,其他结构均可被替换成外源基因序列。在了解腺病毒的反向末端重复序列(ITRs)和包装信号(Ψ)的结构和功能基础上,人们建立了第三代腺病毒载体,即辅助病毒依赖型腺病毒载体(Helper-dependentadenovirus,HD-Ad)。此类腺病毒载体只保留最小数量的顺式作用元件,如ITRs和Ψ,留出空间以安排外源基因及其表达的调控元件以及其他填充片段,产生新病毒所需的基因和蛋白由辅助病毒或包装细胞提供。此腺病毒载体的最大容量理论上可达36000bp。腺病毒载体基因组存在最小包装限制性,Parks等证实了为达到有效和稳定的扩增病毒载体,HD-Ad载体的基因组大小最终需定格在27000~36000bp之间,即有效包装下限约为野生型腺病毒基因组长度的75%,若低于此限,则需额外插入适当的DNA作为填充物。填充物的选择一般应遵守以下原则:人源化,无重复序列,无已知基因,并且有与腺病毒基因组相似的GC含量。为了得到相对纯化的HD-Ad制剂,辅助腺病毒基因组的包装和增殖,必须通过选择性的减毒机制来控制,一般采用Cre/LoxP系统。在辅助腺病毒包装信号的两侧分别插入一段同向排列的LoxP序列,用表达Cre重组酶的HEK293细胞系(293Cre)作病毒包装细胞。辅助病毒和载体共同感染293Cre细胞后,辅助病毒的2个LoxP序列间的包装信号被重组酶切除,但辅助病毒可为HD-Ad提供包装所需的结构蛋白;同时HD-Ad包装时,辅助病毒的DNA被排除在病毒衣壳之外。因此经数轮扩增后,再通过2~3个循环的连续CsCl密度梯度离心,将HD-Ad载体纯化出来。有研究表明这个系统可以将辅助病毒的污染率降低到0.1%~0.01%。Ng等又开发了FLP/FRT系统,用酵母的FLP重组酶和FRT序列分别替换Cre重组酶和LoxP序列,为载体的生产提供了另一个选择。第三代腺病毒载体HD-Ad由于缺失大部分病毒编码序列,因而有效地减少了机体的免疫反应,使治疗基因的表达持续时间明显延长;同时由于缺失了病毒编码序列,大大提高了载体的包装能力,可达到36000bp,可同时表达多个基因、大分子蛋白的cDNA和一些可控制基因表达的调控因子。但HD-Ad存在3个限制因素,影响其在临床上的广泛应用:①难于大规模生产病毒载体;②存在少量辅助病毒的污染;③仍可引起宿主的免疫应答,影响外源基因表达的持续性。3.关于构建胰腺疾病载体的科学研究3.1重组病毒载体细胞是早期采用的方法,即将带有目的基因的穿梭载体小质粒和带有腺病毒基因组的大质粒共同转染包装细胞——293细胞,这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组,形成重组腺病毒载体基因组,并包装成病毒颗粒,此方法效率较低。3.2重组病毒颗粒的制备1998年,He等构建了Ad-Easy系统,用来代替传统腺病毒重组系统,即将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒转化至携带有腺病毒大部分基因组质粒的细菌,在细菌Cre重组酶的作用下重组,获得重组腺病毒载体基因组的质粒,经抗性筛选、扩增,提取质粒,酶切纯化后转染293细胞,在其中包装成重组病毒颗粒。此方法重组过程在细菌内完成,操作相对简单,且同源重组率在60%以上,效率较高,因而得到较广泛应用。3.3cre重组细胞的构建Ng等在2000年构建了该系统,该方法首先分别构建了插入外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组并插入Cre基因表达盒的包装质粒,然后共转染293细胞,在细胞内高效表达Cre重组酶,并在重组酶的作用下重组,产生重组腺病毒。这是目前包装效率最高的方法,效率比早期双质粒共转染法提高近100倍。4.病毒防护装备的发展趋势4.1外源基因的表达一直以来,人们都在试图利用更强的启动子及调控序列,来提高腺病毒携带的外源基因在细胞内的表达水平。Massie等通过对巨细胞病毒(CytomegalovirusCMV)启动子的优化,得到CMV5启动子。然后分别构建腺病毒载体AdCMV-GFPQ和AdCMV5-GFPQ,实验对比在此两种启动子下红移绿色荧光蛋白(GFPQ)的表达情况。结果显示,同样滴度下感染允许细胞即293细胞后,后者的蛋白表达量约为前者的6倍。另有一组实验表明,在感染非允许细胞情况下,AdCMV5-GFPQ的使用量仅为AdCMV-GFPQ的1/50即可达到同样的蛋白表达水平。因此,对于治疗基因而言,可以更少的病毒用量达到预期的治疗目的。由于减少病毒的使用量,进而可以降低病毒造成的毒性作用和免疫原性。但是由于腺病毒载体携带的外源基因的表达往往会有一定的细胞毒性,即使没有细胞毒性的基因中度水平的表达,也会明显阻碍病毒载体的复制和扩增,因此给制备高滴度病毒造成了很大的困难。为了解决这一矛盾,人们对现有载体进行了改造。Matthews等设计构建了一个新的腺病毒载体表达系统,来表达狂犬病病毒G蛋白(RG),该系统采用对外源基因表达效率更高的MCMV启动子,并在外源基因的上游插入了一个乳糖操纵子来控制基因的转录,同时构建了一株能表达乳糖抑制子(Lacrepressor)的293细胞,即293LAP13细胞,用于包装腺病毒载体。结果显示,在293LAP13细胞中,外源基因的表达明显受到抑制,因此病毒的复制扩增不受影响,而在其他细胞中,外源基因的表达不受任何抑制,并且在MCMV启动子的作用下表达量明显提高。Microbix公司利用该原理推出了“HI-IQ”系统,既能高产制备腺病毒载体,又能大大提高外源基因的表达水平,从而提高治疗效果,因此已得到广泛应用。谢庆军等在此系统基础上进一步改进,在外源基因p53的启始密码子ATG周边整合了能够提高基因转录和翻译效率的Kozak序列,研究结果发现可明显提高p53的表达水平。4.2表达外源基因的能力前述的三代重组腺病毒载体均属于复制缺陷型,在体内产生无增殖能力的腺病毒。感染细胞后,由于失去复制能力,加上机体内免疫系统的清除作用,表达外源基因的时间相对较短。目前,具有选择性增殖能力的特殊腺病毒载体的开发,尤其是其在肿瘤方面的应用已引起了人们的重视。4.2.1腺病毒能够检测细胞的作用目前人们已开始尝试用增殖型腺病毒来治疗肿瘤,可通过多种机制杀伤肿瘤细胞:①直接在肿瘤细胞中复制、包装,最终导致肿瘤细胞裂解,并扩散到邻近细胞;②腺病毒在细胞复制过程中,能产生对细胞具有毒性作用的毒性蛋白;③腺病毒能溶解肿瘤细胞,释放肿瘤抗原,使机体产生抗肿瘤免疫反应;④增殖型腺病毒载体经改造,插入某些抗癌基因,随着病毒的增殖,外源基因大量表达,杀灭肿瘤。4.2.2基因重组人的产生和浓度是造成腺病毒复制的主要原因目前条件增殖型腺病毒的改造机制主要包括两个方面。一方面,E1a和E1b是启动腺病毒复制的关键基因,其编码的蛋白分别与宿主细胞内抑癌基因Rb或p53的产物p105或p53结合,从而消除了Rb或p53基因抑制病毒增殖的作用。当E1a或E1b突变后,在正常细胞内Rb或p53可抑制腺病毒的复制,而在大多数肿瘤细胞中存在Rb或p53基因的突变,无法抑制腺病毒复制。因此,E1a或E1b突变了的腺病毒可选择性地在这类肿瘤细胞内复制。我国于2005年11月15日,批准了一类抗肿瘤新药重组人5型腺病毒注射液H101,就是利用基因重组技术得到的一种删除了E1b部分基因片段的溶瘤腺病毒,可特异地杀伤癌细胞。临床观察结果表明具有良好的安全性和明确的治疗效果。另一方面,通过某些病理条件下表达的基因的启动子以及某些特定组织表达的特异蛋白质的启动子来控制病毒增殖所必需的基因,前者包括肝癌的甲胎蛋白(AFP)启动子、胃癌及结肠癌的癌胚抗原(CEA)启动子、端粒酶启动子、环氧化酶-2(Cox-2)启动子等;后者包括甲状腺球蛋白启动子和前列腺细胞特异性抗原(PSA)启动子等。其中CV706的构建是在E1a的上游插入PSA启动子和前列腺特异性增强子(PSE)调控E1a的表达。研究表明,其在PSA阳性的前列腺肿瘤细胞中有效复制,联合放疗可以起明显的协同作用。此外,某些肿瘤治疗方法能够诱导特定基因的表达,如放疗能够诱导早期生长应答基因1(EGR-1)的表达。利用该基因启动子联合放疗来控制病毒的增殖,取得了一定进展。4.3增加腺体损伤带的抗剂效果4.3.1降低病毒残病和毒力近几年来,关于提高腺病毒载体靶向性的研究已成为一大热点。与传统的腺病毒载体相比,该病毒载体仅能感染靶组织或靶细胞,因而最大程度地减少了病毒的用量,大大降低了免疫原性和毒性,增加了安全性。另外,由于某些类型的细胞(如造血干细胞)的CAR表达很少,传统腺病毒载体无法有效感染此类细胞,因此也有必要对腺病毒载体进行靶向性改造。4.3.2靶向性转染途径靶向性转染策略能够提高病毒专一性转染目标组织的能力。目前主要有两种靶向性转染途径,即遗传改造途径和物理途径,通常也被称为单组分法和双组分法。通过修饰腺病毒衣壳或插入配体和/或封闭天然的受体,使腺病毒识别细胞表面特异性受体。4.3.2.文化内涵载体构建纤毛结节区上的HI环常被用于插入一个可与整合素相结合的CDCGRDCFC(RGD-4C)的短肽,使腺病毒感染不必依赖CAR的表达。RGDTKSSTR就是这种经过RGD-4C修饰的病毒载体,研究表明,RGD-4C修饰增强了病毒对卵巢癌细胞的感染能力,并具有较高的安全性。还有研究者在腺病毒纤毛结节区的C-端插入外源性的短肽,也获得了靶向重置的效果。但研究证实,在HI环插入RGD-4C的腺病毒介导的转基因表达比在C-端插入RGD-4C的腺病毒高。另外也有