hv古细菌srp19表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

hv古细菌srp19表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

信号识别颗粒（srp）是一种由所有生物材料中的rna和沉积物组成的一般组合。它的主要功能是通过SRP循环识别并结合核糖体上新生分泌性蛋白质的信号肽序列,介导此类蛋白质穿过内质网膜,被定向地运输到体内的合适部位。SRPRNA和SRP54蛋白是所有生物的SRP所共有的两种根本的成分。大多数细菌的SRP,仅含有上述两种成分;古细菌的SRP,除了SRPRNA和SRP54蛋白外,还含有SRP19蛋白;而人类的SRP,则含有1条RNA分子和6条多肽链,它们分别是SRP9/14异二聚体、SRP19、SRP54、SRP68和SRP72蛋白。SRP的功能必须在全部成分聚合形成颗粒后才能发挥,其颗粒的形成以SRP19结合SRPRNA为开始,因而SRP19对诱导SRP颗粒的形成具有重要的作用。SRP在进化上高度保守,不同种系的SRP成分在结构和功能上有很大的一致性。古细菌是最原始的生物形式之一,令人难以置信的是古细菌SRPRNA的二级结构与真核细胞的十分相似,某些古细菌SRPRNA可以替代人的SRPRNA用于研究SRP的结构和功能,这是因为已有的研究结果表明,古细菌SRPRNA在结构与功能上均与真核细胞的相似。有关古细菌SRP的研究多年来一直是国外的热点。研究古细菌的SRP,可以从最早期的生物中获得蛋白质生物学的信息,为进一步研究SRP的作用机制以及为阐明到目前为止仍未明了的蛋白质的跨膜运输的分子机制奠定基础。古细菌的SRP因SRP54蛋白的结构较细菌的完整,同时含有细菌所没有的SRP19蛋白;它的SRP成分虽较真核细胞的简单,但功能却与真核细胞的SRP相似。因此古细菌的SRP比一般的模式生物有更多的优点。HalophilicarchaeonHaloferaxvolcanii(Hv古细菌)是一种细胞浆内Na+和K+含量极高在高盐环境下生长良好的微生物。Hv古细菌属于蓝杆菌科(Halobacteriaceae)之富盐杆菌属(Haloferax),又称作极端嗜盐古细菌。本文报道Hv古细菌的SRP19蛋白表达载体的构建、表达、纯化、生物学活性的研究及环境因素(高盐)对SRP蛋白与SRPRNA相互作用的影响。1材料和方法1.1dna的合成Hv古细菌SRPRNA(HvSRPRNA)的质粒pHvSR的制备与pET23d-HvSRP19表达载体的构建相似,也是通过体外合成的方式获得的,因为篇幅所限另文报道。SRPRNA合成的试剂盒(MEGA短转录试剂盒)购自Ambion公司,DH5α和BL21(DE3)pLysS感受态细胞自行制备,限制性内切酶NdeI、HindIII及StyI购自NewEnglandBiolabs公司,Q-Sepharose阴离子交换层析柱及FPLC蛋白纯化系统为AmershamBiosciences公司产品,透析袋购自Spectrum公司,质粒DNA小抽试剂盒为Fermentas公司产品,质粒DNA大抽试剂盒及蔗糖购自Sigma公司,16×76mm的Quick-Seal离心管、NVT65转头及离心机为Beckman公司产品。1.2重组质粒的构建pET23d-HvSRP19重组质粒表达载体是根据GenBank注册序列号为AY138586的Hv基因组的序列,通过体外合成的方式,先合成具有重叠碱基的10个寡核苷酸序列(48～60个碱基):(10组寡核苷酸包含了HvSRP19基因的完整序列,经拼接后即可获得HvSRP19的基因。寡核苷酸序列的合成与常规的PCR引物合成相似,由公司完成。)再在ATP提供能量的条件下,由T4多核苷酸激酶催化寡核苷酸链间碱基的连接,获得HvSRP19蛋白的基因全长DNA(279bp),经序列分析,确定该片段含有编码HvSRP19蛋白的完整阅读框后,在5′与3′端分别引入限制性内切酶NdeI及HindIII位点,克隆入pET23d质粒载体而构成的。序列经酶切初筛鉴定和DNA测序确定后,用常规氯化钙转化方法转化入E.coliDH5α感受态细胞中,分别用小量及大量质粒抽提试剂盒制备pET23d-HvSRP19重组体质粒。(1)ATGGTGGAAAACGTGATTTATCCAGCGTATCTGGATGCGAGCCTGAG(2)CGCAGCGAAGGCCGCCGTGTGGCGCAGAGCGCGGCGGTGGAAGCGCCGACCGTGGATG(3)AAATTGCGAAAGCGGTGCAGCAGGTGGGCTATGATGCGGTGATTGAACGCGATAAACG(4)CTATAGCCGCGAATTTGAAACCCGCGGCCGCGTGCTGGTGAACAACGCGGATGATGCG(5)ACCAAAAACGATATTGTGCAGGCGGTGGCGGCGTATGTGGGCATTCTGCGCGATTAAA(6)GCCTTCGCTGCGGCTCAGGCTCGCATCCAGATACGCTGGATAAATCACGTTTTCCACCA(7)GCTTTCGCAATTTCATCCACGGTCGGCGCTTCCACCGCCGCGCTCTGCGCCACACGGCG(8)GCGGCTATAGCGTTTATCGCGTTCAATCACCGCATCATAGCCCACCTGCTGCACC(9)ATCGTTTTTGGTCGCATCATCCGCGTTGTTCACCAGCACGCGGCCGCGGGTTTCAAATTC(10)CTTTTAATCGCGCAGAATGCCCACATACGCCGCCACCGCCTGCACAAT1.3表达宿主e.colibl21de3pluss-气调表达将pET23d-HvSRP19质粒用常规氯化钙转化方法转化入表达宿主E.coliBL21(DE3)pLysS感受态细胞中,按常规方法用IPTG进行诱导表达,用15%SDS检测表达产物。1.4超声辅助培养HvSRP19的纯化,以作者先前介绍的纯化人SRP54M-ΔC1、54m与SRP54M-A3人工突变体蛋白的方法为基础加以改进:取1600mlIPTG诱导后的细菌培养物,离心后向菌体沉淀加入裂解液(20ml/g),用超声作用破坏细胞,离心,除去上清。沉淀再悬浮于20ml裂解液,并逐渐地加入尿素,终浓度达5mol/L,再次超声处理后透析,40000r/min离心2h,上清加至Q-Sepharose离子交换层析柱。用浓度梯度为10mmol/L至1mol/L的NaCl洗脱层析柱,合并相应组分,透析脱盐及浓缩至6.5mg/ml,置-20℃保存。1.5转录生成hvsnprna在体外,以StyI酶切的pHvSR质粒DNA为模板,用MEGA短转录试剂盒提供的T7RNA聚合酶、4种NTP等为材料,按作者先前报道的方法,转录生成HvSRPRNA。1.6不同浓度蔗糖密度梯度液的制备SRP是通过各成分之间相互作用形成复合物后聚集成颗粒而发挥生物学功能的,因此纯化的HvSRP19蛋白的生物学活性可通过分析其能否与HvSRPRNA相互作用形成复合物而确定。将蔗糖溶解在含50mmol/LMgSO4的低盐缓冲液中或含1mol/LKCl(或1mol/LNaCl)的高盐缓冲液中,使成10%与40%两种基本浓度后,按不同的比例进行混合,制备成9种不同浓度的蔗糖密度梯度液,最高40%,最低10%。用注射器以由低向高的次序取不同浓度的梯度液各1.3ml置于16×76mm的Quick-Seal离心管,顶层为40%,底层为10%,共9层。取40μg的HvSRPRNA、16μg的HvSRP19蛋白于1×结合缓冲液中,用水使总体积为400μl,置37℃10min后将反应混合物加于梯度液的上端,同时设仅含HvSRP19蛋白不含HvSRPRNA及仅含HvSRPRNA不含HvSRP19蛋白的对照管,以及16μg的牛血清白蛋白(BSA)(MW:67kDa)作为无关蛋白的对照。以55000r/min的速度,用NVT65转头,4℃超速离心4.5h。以从底向顶的次序收集梯度液,每管约650μl,共18管。分别用15%的SDS和2%的琼脂糖凝胶电泳检测各管的蛋白质和RNA,结果用Bio-Rad的凝胶成像仪的QuantityOne程序分析。2结果2.1最佳转化菌落的确定利用体外合成途径构建的pET23d-HvSRP19表达载体转化入表达宿主E.coli感受态细胞中的转化率为每微克质粒DNA产生2×107个转化菌落;用小量及大量质粒抽提试剂盒制备的大量纯化的pET23d-HvSRP19重组体质粒,经NdeI及HindIII双酶切后可见大小约为280bp的目的片段(图1)。测序结果表明,pET23d-HvSRP19表达载体中的HvSRP19的基因序列与GenBank报道的完全一致。2.2分子质量和分子表达将pET23d-HvSRP19质粒转化入E.coliBL21(DE3)pLysS感受态细胞后,在IPTG诱导下,目的基因能稳定且高效表达出一条分子量约为10kDa的特异蛋白带(图2),与理论计算的分子量(10153Da)相符。大量的表达产物经Q-Sepharose阴离子交换层析柱的纯化后,在SDS中表现为一条蛋白区带,纯度约为95%(图2)。2.3hvsnprna的检测经纯化后的HvSRP19与HvSRPRNA的反应混合物上样于蔗糖密度梯度液,超速离心后,SDS(蛋白质)和琼脂糖凝胶电泳(RNA)显示:在既含蛋白质又含RNA的反应混合物的18个收集管中,蛋白质与RNA的峰值均出现在第5管,明显不同于仅含有蛋白质游离体(其峰值在第16管)与RNA游离体(其峰值在第6管)的对照(图3a);而作为无关蛋白的对照,无论HvSRPRNA的存在与否,BSA的峰值均在第13管(图3a)。表明BSA不与HvSRPRNA发生反应;HvSRP19与HvSRPRNA在低盐的条件下能相互作用而发生特异性反应,形成了HvSRP19-HvSRPRNA的复合物。2.4高盐条件下,hvdrp19的表型SDS(蛋白质)和琼脂糖凝胶电泳(RNA)显示:在18个反应混合物管中检测不到复合物的峰,检测到的蛋白质与RNA的峰与未反应的对照管的峰完全一致:均在第16管及第6管(图3b);明显不同于它们在低盐条件下相互作用形成的复合物(峰值在第5管)(图3a)。表明HvSRP19在高盐的状态下,不与HvSRPRNA发生相互作用、不形成复合物。作为无关蛋白的对照,无论HvSRPRNA的存在与否,BSA的锋值与在低盐条件下相同,均在第13管(图3b)。3hvsrp19表达载体的构建及应用SRP通过SRP54蛋白识别、结合信号肽序列参与新生蛋白质的共翻译易位,由此介导蛋白质的跨膜定向运输。共翻译易位事实上包括尚未完全清楚其机制的两个步骤:首先是SRP54蛋白识别并结合核糖体-新生蛋白质复合物(RNC)中新生蛋白质的信号肽序列使核糖体的翻译速度降低;然后是SRP54-RNC三维复合物与内质网(ER)膜上的SRP受体(SR)结合,SRP54释放信号肽,后者再插入到ER膜上的蛋白通道上,与此同时,SRP与RNC分离,核糖体恢复翻译,而新生蛋白质则易位穿过ER膜。SRP54必须先与SRPRNA相互作用发生构象改变使信号肽结合沟的形状改变才能结合信号肽,这一过程需要SRP19蛋白的帮助;在SRP的全部成分中,SRP19不但首先结合SRPRNA、诱导SRP的形成,而且辅助SRP54与SRPRNA的结合,因此SRP19在SRP的功能发挥中起重要作用。虽然近来有研究报道,某些古细菌的SRP54可不依赖于SRP19而直接结合SRPRNA,但研究结果也证明:缺乏SRP19的辅助,古细菌的SRP54与SRPRNA结合得不完全。我们根据GenBank提供的最原始的生命形式之一:Hv古细菌中SRP19蛋白的基因序列,在缺乏PCR扩增所需的模板DNA的条件下,应用体外合成的DNA重组技术构建了pET23d-HvSRP19表达载体并进行了鉴定,结果表明,编码HvSRP19蛋白的基因的完整阅读框的序列完全正确且所表达的目的蛋白的分子量(约10kDa)与理论计算的10123Da相符。HvSRP19表达载体的成功克隆和表达,不但为研究SRP19辅助SRP54参与的共翻译易位提供了基础,而且由于HvSRP19蛋白质的氨基酸组成较为特殊:天门冬氨酸含量较高而赖氨酸含量较低而具有抵抗高盐的特性,使我们研究高盐对SRP的结构、其成分的相互作用及功能的影响得以实现。由于HvSRP具有抵抗高盐的特性,因此研究HvSRP蛋白与HvSRPRNA的相互作用即结合反应无法应用我们先前报道的用DEAE-Sepharose微型柱层析结合SDS的方法,仅可用蔗糖密度梯度超速离心法进行分析。HvSRP19与HvSRPRNA反应混合物在低盐条件下的蔗糖密度梯度超速离心液中的蛋白峰与RNA峰重叠,均在第5收集管,