基于16srdna技术的rb-19微生物群落指纹图谱研究

基于16srdna技术的rb-19微生物群落指纹图谱研究

生物膜防水好氧循环系统（bis）具有脱水法和好氧法的优点。它不仅能有效地分解环境中严重的芳类化合物，而且能有效分解稳定的化学结构和难以分解的氨基酸和磺酸。在这些降解过程中,系统内的微生物起着至关重要的作用。然而,到目前为止,各种研究主要集中在工艺优化上,对系统中起主要降解作用的功能微生物缺乏相应的了解。点亮这个“暗箱”,充分了解系统中各种微生物在降解过程中的作用,对优化系统运行、提高处理效果都具有重要的实际应用价值和理论探索意义。近年来,随着现代分子生物技术的发展,有关不同的处理工艺内污泥或生物膜中微生物群落结构的研究在国内外均取得了一定的成果。肖勇等采用PCR-DGGE技术研究处理垃圾渗滤液序批式生物膜反应器(SBBR)中的细菌多样性,结果表明,在该SBBR中有多种硝化细菌与反硝化细菌、好氧反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌共存;刘惠军等利用FISH技术分析炭膜曝气生物膜反应器硝化作用及其微生物群落结构,结果显示生物膜内亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)和亚硝化螺菌(Nitrosospira)为亚硝化细菌优势菌种;陈谊等采用PCR-DGGE技术对膜生物反应器中不同阶段微生物群落结构演变研究时发现,微生物的群落结构能随着反应器运行状况的变化做出调整恢复。为了更为深入地探索BHARS中微生物群落的多样性和演变规律,本研究首先考察BHARS对不同浓度的活性艳蓝的降解情况,其次利用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析上述情况下系统功能微生物的群落动态变化。1材料和方法1.1特殊布活性艳蓝(C.I.ReactiveBlue19)由厦门华伦集团提供,使用前不经过纯化。其他试剂均是分析纯。1.2废水生物处理系统和工艺流程接种污泥取自前埔污水处理厂曝气池(厦门,中国),并分别装入好氧、水解反应器用不含活性艳蓝的培养基进行培养,2周左右生物膜稳定,好氧生物膜总量20±1g(干重),水解膜总量27±2g(干重)。反应器均采用有机玻璃柱制成,好氧反应器容积为6L,水解反应器容积为5L,反应器内挂有软性纤维(D-2型,浙江玉环环保器材厂),具体参数如表1所示。水解反应器的温度控制在35±1℃,溶氧0.4～0.6mg/L;好氧反应器的温度20～25℃(室温),空气流量为2L/min,溶氧4.5～6mg/L。系统循环流量为10mL/min,工艺流程如图1所示。模拟废水的组成:活性艳蓝(RB-19),C6H12O62g/L,NaHCO31.5g/L,NH4Cl0.191g/L,KH2PO40.044g/L。微量元素:CaCl2·6H2O0.01mg/L,FeSO4·7H2O1.55mg/L,MnSO44.95mg/L,ZnSO4·7H2O0.71mg/L,CuSO4·5H2O0.48mg/L,CoCl2·6H2O0.01mg/L。活性艳蓝的初始浓度为100mg/L,当色度和COD降解率稳定后(大概需要12d),从2个反应器中的生物膜上取样保存。完成后,将活性艳蓝浓度提高到200mg/L,重复以上操作,直至浓度达到500mg/L。1.3pcr反应体系污泥中基因组DNA提取采用上海申能博彩的环境样品DNA提取试剂盒(3SDNAIsolationKitV2.2)。PCR反应在MJMiniPersonalthermalcycle(Bio-rad)上进行,采用不同的引物扩增细菌和古细菌中V3-V5中的特异片段,具体针对细菌选择引物F338-GC和R518,针对古细菌选择引物ARC334-GC和ARC915。50μL反应体系组成:1μL模板,5μL的10×PCRbuffer(MgCl2),2μLdNTP,1μL每种引物,0.5μLTap酶(Takala),其余用无菌超纯水补足。PCR扩增程序(细菌)为:起始94℃预变性2min,94℃变性45s,61℃延伸45s,72℃复性45s,30个循环,72℃终延伸10min,4℃保存。扩增古细菌采用Touchdown模式,具体程序如下:95℃预变性5min,95℃变性45s,63～53℃延伸45s,72℃复性45s,20个循环(每个循环退火温度降低0.5℃),95℃变性45s,53℃延伸45s,72℃复性45s,13个循环,72℃终延伸10min,4℃保存。1.4sybrger染色采用Bio-rad公司的DcodeTM系统,凝胶浓度为8%,变性梯度为30%～70%,温度为60℃,缓冲液为1×TAE,电压25V,20min,电压为150V,4.5h,完毕后将凝胶进行SYBRGreen染色30min,并在凝胶成像系统(Kodak,USA)中成像存档。将凝胶中主要的条带进行切割回收,用不带GC夹的引物重新PCR扩增、纯化、克隆,委托上海生工公司进行测序。1.5多样性与聚类分析dgge谱的多样性1.5.1pilogdi1h的计算微生物群落多样性采用Shannon指数(H)表示,公式为:H=-ΣPi·logPi(1)H的计算是基于DGGE胶条带的位置和条带的强度,而条带的强度则通过经凝胶分析软件QuantityOne分析后得到,即Pi=ni/N,其中ni为峰面积,N为所有峰的总面积。1.5.2dppe图谱的构建由于取样较多,而实验主要目的是为了探讨在生物膜水解-好氧循环体系稳定运行的3个月内微生物种群结构的变化,故对得到的DGGE图谱进行UPGMA(unweightedpai-groupmethodusingarithmeticaverages)聚类分析,依据不同样本之条带分布相似程度构建系统进化树。1.5.3微生物组成相似性研究中还采用非度量多维标度排序(NMDS)对所取得的样品中的微生物组成相似性进行分析。非度量多维标度排序的目的是在一个特定的时间内建立一幅样品微生物组成构型图,直观地反映样品间的相似(相异)关系,2个样品越相似,其在构型图上的位置越接近。1.6同源性分析2结果与讨论2.1rb-19的去除整个运行过程RB-19去除情况如图2所示。反应器启动初期,RB-19的进水浓度为100mg/L,出水浓度为3.5mg/L,其去除率约为96%。随着进水浓度的提高,RB-19去除率有所下降,当进水浓度提高到400mg/L时,RB-19的去除率降低到82%,但当进水浓度提高到500mg/L时,RB-19的去除率急剧下降到58%。图3为实验期间循环系统对COD的去除效果。整个运行过程中,进水COD维持在2500mg/L左右。前50d(对应的进水RB-19浓度为100～400mg/L),出水浓度为120mg/L左右(国家二级达标),去除率为95%。在最后阶段,出水浓度提高到500mg/L(三级达标),COD去除率降低到85%。2.2微生物多样性分析针对BHARS运行周期内所提取的10个生物膜样品(A1～A5分别为好氧反应器内RB-19浓度为100、200、300、400和500mg/L时的生物膜样品;H1～H5分别为水解反应器内RB-19浓度为100、200、300、400和500mg/L时的生物膜样品)基因组中总细菌16SrDNAV3区片段338～518位点进行PCR扩增,再进行DGGE分析,结果如图4所示。生物膜中微生物多样性Shannon指数变化趋势如图5所示。对水解反应器内取的5个生物膜样品基因组中16SrDNA的V3～V5区片段334～915位点进行PCR扩增,再进行DGGE分析,结果如图6所示。生物膜中微生物多样性Shannon指数变化趋势如图7所示。Shannon指数是由样品中微生物种属的数量和每个种属的丰度所决定的。从图5和图7中可以看出,BHARS反应器中总细菌Shannon指数的演变经历了一个逐渐减少的过程,这也许是因为RB-19或其降解的中间产物对微生物具有毒副作用。接种来的污泥进入反应器后,由于环境的改变微生物种群数量有一定的减少,而对BHARS中环境能够较好适应的菌种则很好地存活了下来。但是同样的RB-19浓度对水解、好氧2个反应器内的微生物多样性的影响是不同的。在整个实验过程中,好氧反应器内的细菌Shannon指数从1.32降低到1.11,同时水解反应器中仅从1.20降低到1.19,这说明水解反应器内的细菌对RB-19的适应能力强于好氧反应器内的细菌。总细菌多样性的UPGMA聚类分析及细菌群落NMDS散点分布结果如图8和图9所示。由图6可见,根据DGGE条带的同源性,QuantityOne自动将所取的10个样品分为2类独立的群,恰好与循环系统中的2个反应器相对应,这也说明生物膜内种群结构变化与不同的处理工艺运行有着直接关系。图7也证明了这点,并且直观地说明了2个反应器内的微生物并没有因为同处一个系统内而使得其菌群落结构产生明显的趋同倾向。2.3细菌对rb-19的致病性将图4和图6中主要条带进行切胶测序后,在GenBank中进行比对,获得各条带的同源性信息,结果如表2所列。目前,Genbank数据库中已存有大量各类微生物的基因组和保守性序列可供检索、比对,这为微生物的分类鉴定提供了丰富的生物信息学资源。DGGE谱图中的每一条带代表一个可能的细菌类群或可操作分类单位(OTU)。由表2可知,所提交的条带在GenBank中找到了与其同源性较高的种群。本研究中所分离得到得几个在整个实验过程中始终保持优势地位的菌种如1、2和4(图4),既存在于好氧反应器中又存在于水解反应器中,虽然由于有葡萄糖的存在不能说明这些菌种就是降解RB-19的功能菌种,但是这可以说明这些兼性细菌是RB-19的耐受菌。同样,细菌A、B(图6)也属于RB-19的耐受菌。虽然同为RB-19的耐受菌,但是这些菌种对RB-19的耐受程度又有不同。其中,Band_2属于气单胞菌目(Aeromonadales),已有研究发现这种微生物存在于降解蒽醌类物质的体系中,Band_3属于红细菌属(Rhodobactersp.),这2个菌种在RB-19浓度为400mg/L时急剧增加;Band_1属于不可培养的细菌,随着RB-19浓度的提高,数量逐渐减少;说明这类气单胞菌、红细菌对RB-19的耐受程度高于菌种1。Band_4属于链球菌(Streptococcussp.),当RB-19浓度提高到500mg/L时,它在水解反应器中急剧减少几乎消失,对应系统的RB-19去除率、COD去除率大幅度降低,说明这种链球菌在RB-19的降解过程中起到重要作用,具体的作用有待进一步研究。在分离到得2个古细菌中,菌种A属于甲烷杆菌属(Methanobacteriumsp.),这种古细菌具有极强的还原能力,在酸性环境中,Methanobacteriumsp.MB4甚至能将CO2还原成CH4,说明这种细菌可能在这个系统中起到还原RB-19的作用。某些在功能上十分重要的次级细菌群落,不能通过本实验所设计的引物被有效地揭示出来,而这些菌群的演变过程对BHARS的运行效果有着重要的影响。因此,研究者需要运用更为深入的研究手段,如针对这些细菌设计特异性强的探针和引物等,来探讨这些细菌群落结构和系统功能之间的关系。3rb-19浓度对rb-19去除率和cod去除率的影响(1)生物膜水解-好氧循环系统能有效地降解活性艳蓝模拟废水,在RB-19浓度≤400mg/L时,RB-19去除率维持在82%～96%之间,COD去除率维持在95%左右,当