苦瓜水提物对常见食品污染微生物的抑菌活性

苦瓜水提物对常见食品污染微生物的抑菌活性

作为延长食品保留时间，保证食品质量的重要手段，食品洗涤剂在延长食品保留时间方面发挥着非常重要的作用。然而,传统的食品防腐剂主要是化学合成品,由于合成防腐剂可能存在毒性和致癌的问题,在许多国家已被逐步禁止或限制使用。国际上食品添加剂朝无毒、安全、天然方向发展已形成趋势。因此,评价和筛选具有抑菌防腐活性的天然资源已发展成为食品行业研究的新领域。苦瓜是一种食药两用的天然植物,是常用蔬菜之一,具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗病毒、提高机体免疫力能力、抑菌等多种生物活性。已有研究表明,苦瓜提取液对11种165株革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌和革兰氏阴性杆菌具有抑菌抑菌作用,并且对肉类食品具有抑菌防腐作用,说明苦瓜是一种良好的天然广谱抑菌剂。现有对苦瓜抑菌的研究多集中在乙醇提取物方面,由于苦瓜乙醇提取物在水中的溶解度较低,限制了它在食品工业中的应用范围。因此,本实验研究苦瓜水提物对常见食品污染微生物的抑菌作用;并针对食品加工中常见的热处理操作,初步研究苦瓜水提物抑菌作用的热稳定性,以探讨苦瓜水提物作为食品天然防腐剂的应用前景。1材料和方法1.1材料表面1.1.1油瓜类瓜的制备苦瓜粉:实验室自制。以市售新鲜苦瓜(为同一品种的油瓜类苦瓜)作为原料,洗净,用切片机将其切成均匀的薄片,50℃烘干,粉碎,过40目筛,干燥保存。1.1.2真菌和酵母菌种细菌菌种:金黄色葡萄球菌(Staphy-lococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonellasp.)和草杆菌(Bacillussabtilis)。霉菌菌种:黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aaperiyillusoryzae)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)。酵母菌种:啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粘红酵母(Rhodotorulaglutinnis)和假丝酵母(Candidasp.)。上述受试菌种购于广东省微生物研究所。1.1.3培养基牛肉膏蛋白胨培养基(细菌用)和马铃薯培养基(霉菌、酵母用)按照文献配制。1.2仪器、试药与仪器EB-330H分析天平岛津公司;HH-S数显水浴锅上海锦屏仪器仪表有限公司;EYELA旋转蒸发仪日本东京理化器株式会社;LDZX-405AI立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂;LRH-150-Ⅱ型生化培养箱广东省医疗器械厂;SW-CJ-1F超净工作台上海阳光实验仪器有限公司。1.3方法1.3.1苦瓜水提物的制备称取苦瓜干粉,以1:30的重量比例加入蒸馏水,60℃水浴回流提取2次,每次4h,合并滤液,于旋转蒸发仪上浓缩,真空冷冻干燥,得到苦瓜水提物,于冰箱中4℃保存备用。称取适量苦瓜水提物以无菌蒸馏水分别配制成20、40、60、80mg/ml浓度的水溶液备用。1.3.2菌种培养和培养将所有供测试的菌种移接入相应的试管斜面培养,每种接多支重复。细菌置37℃恒温培养箱培养24h;酵母、霉菌置30℃恒温培养箱培养48h。将上述活化好的各种菌分别挑取一环制成初试菌悬液,取适量初试菌悬液用生理盐水将其稀释成含菌量为1.0×108CFU/ml的菌悬液备用。1.3.3抑菌圈直径测定用无菌吸管吸取上述各种菌悬液0.1ml于无菌平皿中,然后倒入15ml已冷却至45℃经高压灭菌后相应的培养基,充分混匀后水平放置,制成含菌平板。用无菌镊子将灭菌后直径5mm的小圆滤纸片置入苦瓜水提物样品液中,浸泡0.5h后取出,贴于平板上,每个纸片相隔一定间距,每种菌各设3个重复,以无菌水作为对照,放入培养箱中,37℃下细菌培养24h,霉菌30℃下培养48h。按时取出,测定抑菌圈直径,取其平均值为测定结果。以上操作均在超净工作台上完成。判定标准:以抑菌圈直径大于5mm者评价为有抑菌作用,无菌水对照组应无抑菌圈产生,否则实验无效。无菌水对照组所测直径为滤纸片直径。1.3.4不同方式抑菌效果测定将苦瓜水提物用无菌水稀释成质量浓度为80mg/ml的溶液,作为原液。取部分原液分别置于40、60、80、100℃水浴和121℃湿热条件下分别处理5、10、20、30min,用未处理的苦瓜原液作为对照,以金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌为指示菌,用抑菌圈直径法测定处理前后样品的抑菌效果。实验重复3次,取其平均值为测定结果。2结果与分析2.1不同水提物浓度的抑菌效果通过测定不同浓度苦瓜水提物样品抑菌圈的直径来评价其对受试常见食品污染微生物的抑制状况。结果如表1所示。从表1可以看出,苦瓜提取物对受试细菌金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草杆菌均有较好的抑制效果,当苦瓜水提物浓度为20mg/ml时就有明显的抑菌现象,而且水提物浓度与抑菌圈之间具有量效关系,抑菌圈直径随水提物浓度增加而扩大。表1的结果也表明,苦瓜水提物对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的抑制作用尤为显著:浓度为40mg/ml时抑菌圈直径均超过10mm、浓度为80mg/ml时抑菌圈直径均在14mm以上,说明苦瓜水提物在用于预防细菌性食物中毒方面具有开发前景。另一方面,表1的结果表明,苦瓜水提物对黑曲霉、米曲霉、桔青霉等受试霉菌和啤酒酵母、粘红酵母、假丝酵母等受试酵母的抑制效果不明显,仅在浓度增加到60mg/ml或者80mg/ml时才出现很小的抑菌圈,且直径均不超过5.5mm,说明苦瓜水提物对上述霉菌和酵母的抑制作用较弱。2.2不同加热温度和时间对苦瓜水提物抑菌效果的影响鉴于苦瓜水提物对受试细菌的抑制效果良好,以金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌为指示菌,测定了不同加热温度及加热时间处理后苦瓜水提物的抑菌圈直径,结果见表2~4。表2~4的结果表明,经过不同加热温度和时间的处理对苦瓜水提物抑菌效果的影响是不同的,苦瓜水提物对三种受试细菌抑菌效果的变化具有基本相同的趋势:当加热温度不超过100℃时,其抑菌活性具有良好的稳定性;尤其当加热温度不超过60℃时,随着加热时间的延长,其抑菌圈直径基本没有变化;当加热温度升高至80~100℃,其抑菌圈直径随温度增加和时间延长略有缩小。当加热温度升高至121℃,抑菌效果明显降低,且随加热时间延长,其抑菌圈直径大幅度降低,但仍然表现出一定的抑菌效果。3微生物及其产物的抑菌活性已有研究表明,苦瓜对革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌和革兰氏阴性杆菌具有较好的抑制效果。本实验证明了苦瓜水提物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草杆菌等受试细菌具有良好的抑制作用,尤其对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌具有显著抑制效果,说明苦瓜水提物在预防细菌性食物中毒方面具有应用前景。已有研究表明,许多植物提取物对霉菌和酵母的抑制作用较弱或没有抑制作用。本实验也表明了类似的研究结果,即苦瓜水提物对受试米曲霉、黑曲霉和桔青霉以及啤酒酵母、粘红酵母和假丝酵母显示了较弱的抑制作用。究其原因,可能因为粗提物中含有利于霉菌和酵母生长的化学成分,削弱了抑菌活性成分对霉菌和酵母的抑制作用,如果将抑菌活性成分分离纯化,则有可能增强其对霉菌和酵母的抑制效果。关于苦瓜水提物抑菌活性成分的确定及其分离纯化尚有待进一步探讨。在苦瓜水提物抑菌活性的热稳定性方面,本研究表明在加热温度温度不超过100℃时,其抑菌活性具有较好稳定性,而当加热温度升高至121℃,抑菌效果随加热时间延长明显降低。究其原因,可能因为高温长时处理使苦瓜水提物中的某些抑菌活性成分发生了化学变化使之抑菌活性降低;或者产生了挥发的物理变化,损失了部分抑菌活性物质,使得抑菌效果降低。4致病菌测定4.1苦瓜水提物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草杆菌大肠杆菌等受试细