hplc法测定卷柏中的卷柏含量

hplc法测定卷柏中的卷柏含量

柏树药物中的主要成分是双黄酮，具有广泛的药理活性。它有效地控制了柏树植物中的双黄酮含量，对确保柏树药物的临床使用具有重要意义。《中国药典》2005年版中收载卷柏属原植物来源为卷柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring及垫状卷柏S.pulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的干燥全草。但《中国药典》质量标准无含量测定。本文建立了穗花杉双黄酮的HPLC测定方法,并增加了穗花杉双黄酮对照品的TLC鉴别,为有效控制卷柏药材及其制剂质量提供了科学依据。1穗花杉双黄酮对照品LC-2010高效液相色谱仪(日本岛津)。卷柏(垫状卷柏)对照药材(中国药品生物制品检定所,批号:121104-200301);穗花杉双黄酮对照品[含量测定用,为本实验室从卷柏(Selaginellatamariscina)中分离得到,纯度大于98%]。实验用样品(中国药品生物制品检定所中药标本馆徐纪民收集并鉴定)。薄层硅胶预制板(青岛海洋化工厂生产)。甲醇为色谱纯,石油醚(60～90℃)等均为分析纯,纯净水为RO-ZY-30型纯水机和Milli-Q纯水系统二次制备,其它试剂均为分析纯。2方法和结果2.1膜层析成像2.1.1试验1,显色剂2硅胶板G预制板;展开剂:异丙醇-浓氨试液-水(13∶1∶1);显色剂:2%三氯化铝甲醇溶液;点样量:对照品、对照药材溶液、样品溶液各5μL;检视:紫外光灯365nm下。2.1.2供试品溶液的制备对照品溶液的制备取穗花杉双黄酮对照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,即得。对照药材溶液的制备取卷柏对照药材粉末2g,加甲醇50mL,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇3mL使溶解,作为对照药材溶液。供试品溶液的制备取本品粉末2g,加甲醇50mL,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇3mL使溶解,作为供试品溶液。薄层色谱图见图1。2.2重量测定2.2.1流动相、检测波长色谱柱:AngilentC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-0.05mol·L-1磷酸二氢钠溶液(65∶35);检测波长:330nm;柱温:35℃;流速:1mL·min-1;进样量:10μL。2.2.2对照溶液的制备精密称取穗花杉双黄酮对照品约4.92mg,置50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,即得每1mL含98.4μg穗花杉双黄酮溶液。2.2.3微孔滤膜的制备取本品粉末(过3号筛)约0.2g,精密称定,置100mL具塞锥形瓶中,加石油醚(60～90℃)50mL,加热回流2小时,取出,放冷,滤过,残渣精密加甲醇50mL,称定重量,加热回流4小时,取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,滤液过0.45μm的微孔滤膜,即得。2.2.4标准曲线的绘制按上述色谱条件,分别精密吸取上述对照品溶液3,5,10,15,20μL,注入液相色谱仪,测得峰面积,以峰面积为纵坐标,穗花杉双黄酮对照品进样量为横坐标,绘制标准曲线。回归方程:Y=3.4956×106X+2.7020×103r=0.9999结果表明穗花杉双黄酮对照品在0.3～1.97μg范围内线性良好。2.2.5精密度测试精密吸取上述对照品溶液,按上述色谱条件重复进样5次,测得穗花杉双黄酮平均峰面积为356502,RSD=0.2%。2.2.6对照品溶液稳定性测定取上述对照品溶液,按上述色谱条件分别于0,4,8,12,16,20小时测定,测得平均峰面积为376116.5,RSD=0.8%,结果表明对照品溶液在20小时内基本稳定。2.2.7穗花杉双黄酮及rsd称取同一样品6份,按“2.2.3”项制备供试品溶液,按上述色谱条件测定,并计算含量,结果穗花杉双黄酮平均含量为1.3%,RSD=0.5%。2.2.8穗花杉双黄酮甲醇溶液的制备采用加样回收法,精密称取已知含量的样品(含穗花杉双黄酮1.34%)约0.12,0.10,0.08g3个不同重量各3份,置100mL具塞锥形瓶中,加石油醚(60～90℃)50mL,加热回流2小时,取出,放冷,滤过,残渣分别按取样量1∶1比例精密加入穗花杉双黄酮甲醇溶液,称定重量,加热回流4小时取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤液过0.45μm的微孔滤膜,即得。按上述测定条件测定,计算回收率,结果见表1。2.2.9样品测定取样品0.2g,按上述方法提取,并测定含量,结果见表2、图2。3讨论3.1穗花杉双黄酮含量测定结果本文建立了卷柏中穗花杉双黄酮成分的RP-HPLC含量测定方法。并测定了14批药材,穗花杉双黄酮含量范围为0.30%～1.66%,并按照穗花杉双黄酮含量测定结果,去除了含量结果较低的数据,规定了本品穗花杉双黄酮含量暂不得少于0.50%。本方法简便,准确,可靠,可为卷柏药材的质量标准的修订提供参考。3.2油醚、近氧化溶剂对双黄酮脂质的影响在含量测定样品溶液的制备过程中,我们比较了石油醚、乙醚、三氯甲烷3种不同溶剂脱脂的效果,经液相色谱测定,发现乙醚和三氯甲烷在脱脂时,均易溶解一部分双黄酮,故本试验采用石油醚脱脂。3.3黄酮类成分测定原拟定对卷柏中除穗花杉双黄酮外,其它黄酮类成分也进行含量测定研究,结果液相色谱图中穗花杉双黄酮的含量很高,故本文只增加了卷柏中穗花杉双黄酮含量测定。3.4可溶性理化成分作为传统活血通经中药,卷柏的药用作用在不断扩大。卷柏属植物目前所研究的成分大部分集中在极性较低的非水溶性部分,主要