岩柏草总黄酮的提取及分离纯化工艺研究

岩柏草总黄酮的提取及分离纯化工艺研究

岩柏树草是柏树科的一种干燥的柏树科植物。它具有冷却血液、止血、清热除湿等功效。它可以用来治疗肝炎、各种内外出血和其他疾病。文献报导其化学成分以双黄酮类为主,主要含穗花杉双黄酮。穗花杉双黄酮具有抗肿瘤、抗病毒、血管舒张作用。我院中药制剂复方茵柏合剂在临床治疗肝炎疗效确切,其中一味药是岩柏草,为了深入研究处方的物质基础,我们对岩柏草的总黄酮进行提取并进行含量测定。大孔吸附树脂是近年来发展起来的新型分离技术,具有价廉、吸附容量大、可反复使用等优点,被广泛应用于中药有效成分分离纯化和天然药物化学成分提取和分离。本实验拟通过大孔树脂纯化岩柏草提取物,以紫外-分光光度法进行总黄酮的含量测定。1dad和bt2Agilent1200型高效液相色谱仪(四元泵、自动进样器、柱温箱、ChemStations色谱工作站、DAD检测器,美国安捷伦科技有限公司),UV-2250型紫外-可见分光光度计(日本岛津);BT25S型分析天平(德国sartorius)。穗花杉双黄酮标准品(自制,HPLC含量测定>99.0%)、岩柏草产地浙江临安、D-101大孔树脂(天津市海光化工有限公司,批号091102)乙腈和甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯。2实验方法2.1样品的制备取岩柏草药材500g,用9倍量70%乙醇回流提取2次,每次lh,提取液过滤、合并、减压浓缩、真空干燥,得到固体22.5g,作为样品备用。取样品适量,加适量热水超声溶解,静置后抽滤,即得岩柏草样品液。2.2d-101是用大孔吸附树脂、纯度和分离黄酮的药物2.2.1碱减量法取适量D-101大孔吸附树脂用3BV无水乙醇浸泡24h,倾倒上层乙醇,然后装入玻璃层析柱,用无水乙醇以2BV/h的流速通过树脂层,至流出液加去离子水不呈浑浊为止,并用去离子水以相同的流速冲洗树脂层至流出液没有醇味为止,然后进入酸碱处理阶段。2.2.2影响岩柏树总黄酮的分离和提取因素(1)总黄酮最佳上样液的确定用D-101大孔树脂饱和吸附质量浓度分别为4.5、6.5、8.5、10.5和12.5mg/mL的岩柏草提取液,以吸附量占总量的百分数作为吸附率,根据树脂对总黄酮的吸附率确定最佳上样液质量浓度。(2)吸附流速的确定将提取液液分别以1、2、3、4mL/min的流速通过D-101大孔树脂,收集每一树脂流出液体积,测定总黄酮质量浓度,根据泄露点及泄漏率的大小确定吸附流速。(3)乙醇最佳体积分数的确定用D-101大孔树脂(树脂体积30mL)饱和吸附总黄酮溶液,先用4倍树脂体积的蒸馏水洗脱,然后分别用体积分数30%、50%、70%、90%的乙醇洗脱,测定总黄酮质量浓度,根据洗脱率大小确定乙醇最佳体积分数。2.2.3指标和方法的检测(1)标准曲线的绘制参照文献的方法,以穗花杉双黄酮标准品为对照,利用紫外分光光度法在338nm波长处测定吸光度,平行测定3次,取平均值以吸光度值(A)为纵坐标,穗花杉双黄酮质量浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程A=85.32C+0.0018(r=0.9996)(2)洗脱溶剂浓度c总黄酮收率采用以下公式计算总黄酮收率/%=(C×V)/(C1×V1)×100%式中:C和V分别为洗脱液中的黄酮质量浓度和洗脱液体积,C1和V1分别为吸附前溶液的黄酮质量浓度和溶液体积。(3)黄酮纯度黄酮纯度采用以下公式计算黄酮纯度%=(C×V)/W×100%式中:C和V分别为洗脱液中的黄酮质量浓度和洗脱液体积,W为干膏质量。2.3l/min/ms条件色谱柱:C18柱(5μm250mm×4.6mm);流动相:乙腈-0.5%醋酸,梯度洗脱;检测波长:338nm;流速:1mL/min。精密称取穗花杉双黄酮适量用乙醇超声溶解配成1.0mg/mL的溶液,精密吸取1mL分别置于100mL、50mL、25mL、10mL、2mL容量瓶中,用乙醇稀释至刻度,摇匀。按测定方法进样20μ,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,回归方程为Y=62621X+39.79(r=0.9994)。穗花杉双黄酮浓度在5.60～280.0μg/mL范围内,呈良好的线性关系。3结果3.1影响d-101个孔树脂吸附岩石总黄酮的单一因素分析3.1.1先有上升后有下降的趋势上样液质量浓度是影响大孔树脂吸附效果的重要因素之一。由图1可见,D-101大孔树脂对总黄酮的吸附率随上样液质量浓度的增大呈先逐渐上升后明显下降的趋势。当上样液质量浓度为8.5mg/mL时,大孔树脂对异黄酮的吸附率达到最大值(99.23%);当上样液质量浓度提高到10.5、12.5mg/mL,分别为94.12%和87.77%。试验中岩柏草提取液质量浓度为11.20mg/mL,树脂对异黄酮的吸附率最低,因此应将其质量浓度稀释至8.5mg/mL进行后续试验。3.1.2发生漏过的温度吸附流速对吸附效果的影响,表现为其对溶质在树脂表面扩散的影响,若流速过高,溶质分子来不及扩散到树脂表面而发生漏过。由图2可见,吸附流速为3mL/min较2mL/min时更早出现泄漏现象。同时流经相同树脂体积时,流速为3mL/min条件下收集的流出液中,双黄酮质量浓度高于流速为2mL/min和1mL/min,说明此时泄漏率明显加大,综合考虑选择吸附流速为2mL/min。3.1.3不同体积分数乙醇岩柏草总黄酮的洗脱能力为保护总黄酮的活性成分、减小毒性,本研究没有选用碱液、甲醇和丙酮等溶剂洗脱,而用毒性较小、价格适中的乙醇作为洗脱剂。由表1可见,对于D-101大孔树脂,不同体积分数乙醇对岩柏草总黄酮的洗脱能力不同。体积分数70%的乙醇,能将大部分黄酮洗脱下来,其洗脱率为69.83%;体积分数90%乙醇的黄酮洗脱率与70%乙醇相差不大。观察洗脱液颜色发现,体积分数90%乙醇的洗脱液颜色最深,呈现棕褐色;体积分数70%乙醇的洗脱液颜色呈现金黄色;体积分数50%乙醇的洗脱液颜色呈浅黄色;体积分数10%,30%乙醇的洗脱液颜色较浅。综上可以确定,体积分数90%乙醇洗脱液可能含有较多杂质,以体积分数70%的乙醇作为洗脱剂最佳。3.2岩柏草总黄酮的测定取适量2.1中样品液加入已经预处理好的D-101大孔树脂层析柱中,以2mL/min的吸附速率进行吸附,然后先以4BV水洗去杂质,再用70%乙醇以2BV/h的速率进行洗脱,TCL跟踪(硅胶薄层,展开剂甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸=5∶4∶1,三氯化铝溶液显色,365nm处观察荧光),至薄层无荧光斑点以后,收集洗脱液,减压浓缩、真空干燥,即为岩柏草总黄酮。将总黄酮用适量乙醇溶解后进样测定穗花杉双黄酮含量,结果见表3。由表3可知,纯化后岩柏草总黄酮的纯度、收率、穗花杉双黄酮含量平均值分别达到80.77%、62.45%和56.49%,说明D-101大孔树脂动态吸附-解吸岩柏草总黄酮工艺的重现性良好。4大孔树脂资源回收利用的条件吸附树脂提纯可用于纯化提取物的主要有聚苯乙烯、聚酰胺吸附树脂、活性炭、硅胶、大孔树脂以及硅藻土等。不同的树脂提纯的效果有很大的差别,主要是由于树脂的结构及性能、吸附液和洗脱剂等因素造成的。大孔吸附树脂是近十多年飞速发展的一类有机高分子聚合物吸附剂,其分离技术的原理是:利用大孔树脂的多孔结构和选择性吸附功能从中药提取液中分离精制有效成分或有效部位。与离子交换法和溶媒法相比,大孔树脂具有物理稳定性高、吸附选择性好、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等优点,并且提取率较高、成本低,适合工业化生产,广泛应用于物质的分离纯化。本试验发现,影响D-101大孔树脂吸附性能的因素,如上样液质量浓度、用吸附流速和乙醇体积分数等,直接影响着双酮类成分的富集效果。适宜的上样