人源化单抗的发作和未来

泰欣生一人源化单抗发展现状及前景一从单克隆抗体到人源化单克隆抗体单克隆抗体自发现以来,便成为人体细胞特异地识别和抗击外来病源入侵而产生的一种生物抗性物质，简称单抗。单抗目前主要用于诊断各类疾病，药物制备技术也日益完善。单克隆抗体制剂研究已取得理想的成果。目前，全球有500余种诊断和治疗用的单克隆抗体投放市场，1130多种用于临床研究。据资料统计，截止到2004年2月，美国FDA已经批准了18种临床治疗的体内单克隆抗体药物；我国也成功的研制了300种单克隆抗体，并已用于肿瘤治疗。单抗具有灵敏度高、特异性强、高效、血清交叉反应少或无、制备成本低等优点，缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性，反复人体使用后可诱导产生人抗鼠的免疫应答，从而削弱了其作用。因此，既保持单克隆抗体均一性，特异性强的特点，又能克服其中鼠源性的不足，是拓展Mab广泛应用的思路。随着DNA重组技术的发展，将部分或全部人源抗体的编码基因克隆到真核或原核表达系统中，体外表达人一鼠嵌合或人源化抗体；或转基因至剔除自身抗体编码基因的小鼠体内主动免疫，诱生人源抗体。因此，基因工程抗体的根本出发点是解决鼠源性问题，其优点是人源化或完全人源化抗体，均一性强，可工业化生产。二人源化单克隆抗体制备方法人源化单克隆抗体制备是从鼠抗体改造而来的，主要方法包括嵌合抗体、表面重塑抗体、重构抗体。嵌合抗体：利用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体，其人源化程度达到70%左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和性，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗体人保留了30%的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应HAMA。表面重塑抗体：对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换;另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区(CDR)构象的残基尽量不替换。重构抗体：由异源抗体中抗原结合相关的残基与人抗体从新拼接构建的，包括CDR区移植，部分CDR移植和特定决定区(SDR)转移。三中国第一个基因重组人源化单克隆抗体药物一一泰欣生2005年，北京百泰生物药业有限公司研究开发的单克隆抗体药物"泰欣生”正式获得了国家食品药品监督管理局批准的国家一类新药证书，成为中国第一个治疗性人源化单克隆抗体，为中国生物技术产业注入一剂“兴奋剂”。泰欣生在中国生产上市，填补了我国生物制药的两大空白：哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白类药品的空白和中国治疗性人源化单克隆抗体的空白。该项目是国家'863计划”新药开发重大专项，它的问世成就了一项我国肿瘤治疗领域划时代意义的重大成果。抗体药物的开发是目前全球生物技术产业的热点，在生物制药领域占有极其重要的地位，被认为是目前生物医药研发的主流方向之一。目前在世界销售额前10位的生物药物中，抗体药物就占了4个。而重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体“泰欣生”，其人源化技术和大规模培养工艺的突破，将中国生物制药重新引领到世界的主流方向，市场前景非常广阔。四从泰欣生研制历程窥视人源化单抗发展单克隆抗体是生物医药的重要组成部分，继重组蛋白后，单克隆抗体引领了第二次生物医药产品浪潮。它在疾病治疗上具有广阔的应用前景，已被成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病，成为生物制药的最大产品类别。单抗药物发展经历了鼠源性单抗，嵌合性单抗、人源化单抗和全人源化单抗四个阶段，鼠源单抗是用小鼠制备的普通单抗药物，由于其100%鼠的成分，免疫原性非常强，常引起人体的免疫反应，毒副作用明显，大大制约了其在临床应用领域的发展，而与人体结合性最好的全人源化将是未来的发展方向。1、 单克隆抗体发展历程1975年单克隆抗体一杂交瘤技术宣告诞生1982年应用抗体治疗淋巴瘤取得成功1986年OKT3单克隆抗体被美国FDA批准上市1988年单克隆抗体用于肿瘤治疗效果不佳1993年抗内毒素单克隆抗体试用于治疗败血症性休克失败1994年抗17-1A和ReoPro上市1997年，位于美国的基因泰克公司成功研发出世界上第一个人源化的单克隆抗体药物（以下简称单抗药物），迈出了单抗药物产业化的第一步。1998年单克隆抗体进入大量审批上市阶段2002年第一个全人源化抗体Humira上市2006年FDA批准21种单克隆抗体药物上市2、 泰欣生发展历史1998年，基因泰克的成功令时年50岁的白先宏萌生了创业的想法。之后，在白先宏的努力下，北京精益泰翔公司投资了百泰生物，而古巴分子免疫中心通过出让技术，占据百泰生物25%的股份。2000年，百泰生物正式成立，中国和古巴在生物技术领域水平最高、投资规模最大的合作项目，公司以研发和生产治疗恶性肿瘤的人源化性单克隆抗体和疫苗为主营方向，承担了国家高新技术产业研究发展（863）计划、国家高技术产业化示范工程等重大项目。然而要想研究出真正的产品来，人源化技术是百泰生物面对的一大技术难点。人源化技术的难点在于它需要大量的学科集成，非常复杂。它需要将带有抗体的小鼠细胞，改造成与人类相似的细胞，使之接近于人体自身的抗体，从而消除人体免疫系统对异源性蛋白的排异反应。百泰生物药业采用先进的“CDR移植”技术，开发出的泰欣生人源化程度高达95%,达到国际同类产品领先水平。2002年，百泰生物完成了临床前的研究，拿出了泰欣生中试样本，开始进入临床。2005年，百泰生物药业成功开发了我国第一个人源化单抗药物一一泰欣生尼妥珠单抗，并获得药监局的新药证书，填补了我国人源化单抗药物的空白。泰欣生用于治疗头颈癌、结直肠癌、神经胶质瘤、非小细胞肺癌等多种癌症，然而，产业化又成为百泰生物面对的另外一个难题。生物制品和中药、化学药不同，把在实验室完成的实验进行量化生产是一个非常大的技术跨越，怎么把实验室的流程变成生产线，如何进行厂房规划，达到实验室里面特定的条件，如何设置生产线等等，都需要摸着石头过河，自己去摸索。百泰生物到古巴公司学习回来之后，自己照猫画虎做了一套设备规划，然后跟设备供应商经过长达数月的协调，最后确定了需要何种设备、信号如何输出，确定了最后生产线方案。一年之后，生产设备终于制造完成，运到百泰生物。此时，公司便开始进行积极的生产调试。幸运的是，调试非常成功，我们实现了泰欣生的批量生产。”2008年，泰欣生获得国家食品药品监督管理局的上市许可证终于成功上市，成为国内唯 个单抗体药物。3、CDR移植抗体为了减少鼠源成分，出现了CDR移植抗体或改型抗体(ReshapedAb)。这是更为完全的人源化抗体，即真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区(CDR)是鼠源的外，其余全部是人源结构。国家I类癌症治疗新药“泰欣生”，即“泰欣生重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体”，采用了先进的“CDR移植”技术，人源化程度达到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性.CDR移植抗体，又称改型抗体。它是在嵌合抗体的基础上，利用基因工程技术，进一步用人的F代替鼠FR形成的只剩3个鼠源CDR的更为完全的人源化抗体。由于具有支持作用的FR不仅为CDR的构想提供了环境，还参与抗体结合位点正确构像的形成和抗原的结合，常常使得CDR移植抗体的亲和力和特异性大大降低，甚至还丧失了抗原结合能力。通过大量研究，我们发现选用与鼠源单抗具有高度同源性的人源抗体，但保留鼠源单抗中的一些关键氨基酸残基，并在此基础上对鼠CDR和FR的一些表面氨基酸残基进行修饰或重塑，对关键氨基酸残基进行一定的改变，在保留CDR移植抗体的亲和力和特异性下大大降低其免疫原性。因此对于嵌合抗体，第二代人源化抗体-CDR移植抗体的人源化程度能达到70%以上，有利于其在临床试验中的应用与研究完全人源。构建人源化抗体的关键在于选择合适的人抗体轻链和重链作为鼠CDRs的框架区，其余的只是基因工程的工作。当用人的序列代替鼠的框架时，其氨基酸残基的接触作用发生改变，影响CDRs的空间构型而使其抗原亲和力降低或消失。可用两种方法解决这一问题:一种方法是选定一个人抗体V区作为框架，然后把鼠抗体的CDRs连同其附近1〜3氨基酸残基一同插入到框架中，检测人源化抗体的活性，反复调换氨基酸残基，直到获得活性较高的人源化抗体;另一种方法是利用计算机分析人和鼠抗体V区框架区的核酸序列，从人体基因库中选出与鼠抗体基因同源性较高的人抗体的框架区，同时分析人抗体和鼠源性抗体氨基酸顺序，找出特殊的或与CDRs空间结构密切接触的氨基酸残基，并将其与CDRs一起插到人抗体框架中。相比之下，第二种方法更为准确，更能获得高活性的人源化抗体o1988年Riechmann首次成功地构建了有活性的人源化抗体，他们首先按照Kabat法查出大鼠YTH34.5HL抗体CDRs所在部位及序列，然后通过六个含有大鼠抗体CDRs序列的寡聚核苷酸将其插到人抗体(New和REI)重链或轻链的V区框架中，构建成整形的重链和轻链V区结构域(HuVHCAMP),然后分三步与C区结构域相联:第一步把整形的重链结构与大鼠IgG2b的C区相联，并转染H链丢失突变的YTH34.5杂交瘤细胞中，比较HuVHCAMP,HuVH2CAMP及大鼠IgG2b的活性，发现HuVHCAMP活性降低;第二步把大鼠重链V区分别与人抗体IgG1,2,3,4C区相译，转染H链丢失的YTH34.5细胞，证明只有与IgGl相联的抗体有活性，故选择IgGl做为框架区;第三步把整形的重链与人抗体C区结构域相联;最后把重新构建的重链与轻链两个克隆转染不分泌Ig的同一鼠骨髓瘤细胞系YO中，结果成功的分泌出能与CAMPATH-l抗原结合的抗体。在构建人源化抗体时要特别注意两个问题:一是要选择同源性较好的人抗体V区做为框架区;另一问题是要对鼠CDRs附近的氨基酸残基进行分析，查出对CDRs空间构型有影响的氨基酸残基，在构建人源化抗体时把这些氨基酸残基与CDRs一起插入到框架区中，否则将会影响人源化抗体的活性。还应注意到被选做为框架区的人抗体V区中也常出现特殊的氨基酸残基，它既不同于人抗体V区的保守序列，也不同于将要人源化抗体的序列，在这种情况下，为保证人源化抗体的活性，应把这些部位的氨基酸残基换成鼠抗体相应位置的氨基酸残基。五国内外批准的人源化单克隆抗体药物1国内批准上市新药：虽然我国的抗体药物市场刚刚起步。但经过20多年的发展，我们已经实现了从基础研究到产业化的跨越。目前，国内形成了、上海、西安等抗体药物的中试及产业化基地。基地以百泰生物药业有限公司和天广实生物技术有限公司等为主形成；上海基地以上海中信国健药业有限公司等为主形成;西安基地由第四军医大学和成都华神集团合作形成。2005年至今，我国SFDA先后批准了四个治疗性单抗药物。尼妥珠单抗注射液即泰欣生于2005年获得批准（百泰生物药业有限公司），用于肿瘤治疗，2008年正式上市。利卡汀，成都华神生物技术有限责任公司，肝癌治疗，2006年。唯美生，上海美恩生物技术有限公司，06年，肿瘤放疗。全重组抗CD25人源化单克隆抗体注射液即健尼哌于2011年01月13号批准上市（上海中信国健药业股份有限公司），用于临床器官移植领域。SFDA已经批准的的13个单抗药物（名单）序号名称公司批准时间治疗领域1尼妥珠百泰生物药业有限公司2005年头颈部肿瘤、消化道肿瘤2唯美生上海美恩生物技术有限公司2006年肿瘤放疗3利卡汀成都华神生物技术有限责任公司2006年肝癌4益赛普上海中信国健药业有限公司类风湿性关节炎5健尼哌上海中信国健药业股份有限公司2011年器官移植2FDA批准上市新药：（未学会使用FDA数据库，所以暂时总结如下）FDA已批准上市的治疗性人源化抗体（截止2004年）抗瘁名称抗休种类靶向抗掠适应证批准日期〈年）Fleopro人鼠嵌合抗体GPIlb/IIIa心肌缺血经皮穿剌冠脉成形术1994JFtitux人鼠嵌合抗体CD20恶性淋巴瘤1997Simulect人鼠巌合抗体CD25移植排斥1998Remicade人鼠嵌合抗体TNT-a炎症性肠病、类凤湿性关节炎1998,1999Zenpax人源化抗体CD25移植排斥反应19^7Herceptin人源化抗休HER-2乳腺羸1998Synagis人源化抗休RSVF蛋白呼吸道合胞病毒感染1998MyloUrg人源化抗値CD33复发性急性白血病2000Campath人源化抗体CD52慢性淋巴细胞白血2001Xoiair人源化抗体IgE哮喘2003Avastin人源化抗体VEGF结直肠癌2004Erbitux人-鼠嵌台IgGlEGFR晚期直肠癌20042005年7月，结直肠癌治疗药帕尼单抗（panitumumab）获得FDA快速通道审批资格。2005年底，安进公司及其合作伙伴Abgenix公司共同向FDA提交了本品生物制剂许可申请用于治疗化疗失败后转移性结直肠癌患者。帕尼单抗是第一个完全人源化单克隆抗体，靶向作用于表皮生长因子受体（EGFR）。EGFR正常情况下帮助调节人体内细胞的生长，但其也会刺激癌细胞生长。EGFR存在于癌细胞的表面，当体内出现蛋白质与EGFR相结合时EGFR会被激活，如表皮生长因子（EGF）或转化生长因子a（TGF-alpha）。结合改变了EGFR的形态，刺激肿瘤细胞的生长。panitumumab与EGFR相结合，可阻止其与EGF或TGF-alpha结合，从而阻断了癌细胞生长。3国家进口人源化单克隆抗体药物：7种。六现有人源化单克隆抗体药物主要治疗方向目前，已经上市的治疗性嵌合抗体与人源化单抗已有10个以上，预计2004年全球该类药物销售额将超过50亿美元。此外，正在报批和处于III期临床研究的治疗性单抗仍有20余个(大部分是人源化单抗)。随着人源抗体技术的日益成熟、靶抗原研究和选择的大规模开展，将有各种功能改善的人源化抗体源源不断地应用于临床。1源化抗体药物在恶性肿瘤及其他疾病治疗中的应用1.1肿瘤治疗方面已上市的人源化单抗Herceptin(trastuzu—ab)由Genentech公司生产，商品名为赫赛汀，是1998年9月被FDA批准上市的人源化IgGl单抗，用于转移性乳腺癌的治疗，其靶向抗原为人类表皮生长因子受体-2(HER.2)°HER—2在多种上皮性肿瘤细胞高表达，包括25%〜35%的乳腺癌。Colomer等试验表明，HER一2在乳腺癌细胞表面的过表达与细胞的恶性转化相关,使其成为肿瘤治疗的靶点。另据Bucbler等报道，Herceptin还可用于胰腺癌的治疗。体内外试验已证明，Herceptin对与高表达HER-2抗原的胰腺癌细胞有抑制生长作用。MylotargT(gemtuzumabozogamicin)由用丫6七hAyerst公司生产，是人源化抗CD33单抗与抗肿瘤抗生素calicheamicin的偶联物。2000年5月18日美国FDA批准上市。本品含有约98.3%人源氨基酸序列，CDR区来自抗CD33抗原鼠源性抗体。抗体通过双功能连接物连接在N-乙酰-7-calicheamicin上。其适应症为复发性急性髓样白血病(AML)的老年患者(60岁以上)。Campath(alemtuzumab)由MillenniumandILEXPannerS公司生产，是一个由大鼠抗CD52抗体Campath-1G经CDR移植改造成的人源化抗体，靶向抗原是在大多数正常和恶性成熟淋巴细胞膜表面高表达的CD52抗原。2001年5月7日美国FDA正式批准其上市，用于传统治疗无效的慢性淋巴细胞白血病(CLL),同年7月12日又获得EMEA批准在欧洲上市，是第1个用于治疗CLL的单抗。1.2非肿瘤治疗方面1.2.1免疫抑制1997年12月美国FDA批准Zenapax(daclizumab,Roche公司生产)上市。这是靶向CD25抗原(Tac，T细胞活化抗原，p55,IL-2受体的a链，IL-2Ra)的人源化单抗，是第1个无严重不良反应的免疫抑制剂，适应证为预防无高度免疫的同种异体肾移植患者的器官排斥反应，与包括环抱素和皮质类固醇的免疫抑制剂方案合用；2002年7月获批准上市，其临床适应证扩展至儿科患者。本品通过将鼠单抗CDR区移植到人IgGl恒定区和Eu骨髓瘤抗体可变区组成的框架上而得，人源化程度可达90%。本品能通过抑制IL-2与其受体的结合而阻断IL一2信号通路,从而阻断免疫反应的发生。在欧洲进行的肾移植临床试验，分别给予患者2种不同的免疫抑制剂治疗，其中本品组的急性器官移植排斥反应的发生率为28%,而对照组为47%；在美国进行同样的试验，本品组的急性器官移植排斥反应的发生率为22%,对照组为35%。本品用于其他自身免疫疾病的临床试验正在进行中。1.2.2病毒性感染1998年，FDA批准靶向呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白A抗原表位的Synagis(palivizumab,Medlmmune公司生产)用于治疗婴幼儿严重下呼吸道合胞病毒感染。2003年6月，FDA最新批准Xolair(omalizumab,Genentech公司生产)上市，它是靶向肥大细胞与嗜碱粒细胞表面IgE受体的人源化单抗，可以阻断IgE与其受体的结合从而限制过敏反应介质的释放程度，用于治疗成人及12岁以上青春期中、重度哮喘患者。2正在进行临床前或临床评价的人源化单抗靶向CD22抗原的epratuzumab是人源化单抗，用于淋巴瘤的治疗，美国Immunomedics公司应用放射性元素Yt(Yttrium-90)标记的抗CD22人源化抗体(9Y-epratuzumab)进行临床试验，证明重复应用后元任何免疫性不良反应，且疗效良好。1986年FDA批准抗CD3鼠源性单抗0KT3进入市场，用于器官移植时的抗排斥反应。但0KT3是鼠源性单抗，首剂反应和HAMA反应严重限制了其临床应用°Hu0KT371(Ala—Ala)是将人CDR区移植到鼠源性0KT3后得到的人源化抗体，Woodle等体外试验表明，HuOKT371(Ala-Ala)保持免疫移植功能，但没有原来0KT3的免疫原性，临床可用于治疗肾移植急性排斥反应。利用基因工程技术构建的xenoMouse小鼠产生的完全人源化抗体ABX—EGF是人IgG2单抗，靶向抗原是多种人肿瘤细胞表面过度表达的表皮生长因子受体(EGFR)，它可阻断EGFR和表皮生长因子的相互作用，能抑制胰腺癌、肾癌、乳腺及前列腺癌等肿瘤的生长，用ABX-EGF治疗表达EGFR的实体瘤临床I期试验已经展开。另外一个人源化抗体KM8969靶向是肺癌细胞表面的神经节苷脂GM2。Parajuli等体外试验表明，KM8969能介导sBG3肺癌细胞的抗体依赖性细胞毒作用(AD-cc)效应。在GLP实验室对抗CD4的人源化单抗hu5A8进行临床前评价，发现其在体