第六章动物人工繁殖

一、动物人工繁殖

包括有性生殖和无性生殖两条途径。前者的关键技术是人工受精与体外受精，后者的关键技术是核移植，两者都涉及胚胎培养与移植。胚胎工程是通过在生殖细胞、胚胎细胞水平上的显微操作技术，来定向控制、改造和创造新遗传性状的技术，是动物细胞工程的拓展和延伸。又称发育工程（revelopmentaltechnology）。第六章、动物人工繁殖二、发展历史及意义

发展历史

胚胎移植技术是胚胎工程的基础。1891年，英国人希普首次在兔子身上成功的进行了核移植。20世纪30年代，陆续在鼠、兔、羊、猪、牛和马进行胚胎移植实验，相继获得成功。20世纪60年代以来，随着胚胎移植技术的不断成熟和规范化，以及一系列新方法的建立，胚胎工程进展迅速，以日本、澳大利亚和加拿大发展最快。1987年，美国用家猫做代理母亲，移植了一只濒临灭绝的珍贵猫的受精卵，成功获得试管猫。我国自20世纪70年代开始发展该技术，进展也较迅速，但与世界先进国家相比，还存在较大差距。1977年，英国科学家首次创造了世界上第一个试管婴儿。意义

1发挥优良母畜的繁殖能力胚胎移植技术是提高母畜繁殖潜力的有效方法，扩大良种雌性配子的推广利用。（超数排卵、同步发情）2促进家畜改良的速度（泌乳高的奶牛、瘦肉型猪、毛肉兼用的细毛羊等）

3作为胚胎操作的基础（卵子切割、性别控制、嵌合体制作、细胞核移植、转基因操作等）

4保存遗传资源胚胎超低温冷冻技术的运用，给长期保存和运输、异地移植带来方便，还可用于建立“胚胎库”等。三、胚胎工程2卵子回收及成熟培养1精子的采集及体外获能精子获能分为体内获能与体外获能体外获能：第一步离心，第二步洗涤改变膜的渗透性3卵子和精子的体外受精（invitrofertilizationIVF）

受精成功的标志至少是看受精卵是否可以发育至囊胚期阶段4受精卵的体外发育及体外培养（一）、人工受精指从某个体采胚或将试管内的受精卵（8细胞以上或囊胚期）移植到另一个体的输卵管或子宫中去的技术。提供胚胎或受精卵的母畜称为“供体”。接受胚胎或受精卵的母畜称为“受体”，又称“代孕母体”或“代理母亲”。来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代，即是所谓的“借腹怀胎”。（二）、胚胎移植（embryotransfer，ET）1胚胎移植的最佳时期体外培养受精卵发育至8细胞以上的胚胎（囊胚期）时是胚胎移植的最佳时期。早期胚胎发育的三个阶段：1）桑椹胚卵裂球分裂到16-32细胞时，成为一紧密的细胞团，称为桑椹胚。在2-8个细胞时，每个细胞均具有全能性。2）囊胚在胚胎内形成空腔，逐渐变大成为囊胚腔，此时一端细胞个体较大，形成密集（三层）的内细胞团（ICM），将来发育成胚体。另一端只有环透明带一层细胞，称滋养层，将来发育成胚膜。3）原肠胚囊胚进一步发育，内细胞团外的滋养层退化，内细胞团裸出形成胚盘，在胚盘下方衍生出内胚层，此时胚胎称原肠胚。(图)（图）（图）下页返回返回返回2超数排卵在母畜发情周期的适当时间用人工方法促使其有更多的卵泡发育、成熟、排卵的一项技术。方法是注射促性腺激素，如孕酮、雌二醇、促卵泡激素、促黄体激素、促性腺激素释放激素等。3同步发情指使供体和受体同步发情，即处于相同的生殖周期。4人工受精和胚胎的采集、鉴别超排卵处理的母体在停药后24-48小时开始发情，此时可进行人工受精，以后约在3-7天从母体采集受精卵或胚胎。正常发育的胚胎，其中细胞(卵裂球)外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象(未受精)和异常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。5胚胎移植外科手术法或非手术法下页胚胎采集：1.手术法2.非手术法返回（三）胚胎分割采用显微操作技术，将早期胚胎切割成多份，再移植给受体母畜，达到实现同卵多胎后代的目的。（四）胚胎融合又称胚胎嵌合。将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内继续发育形成一种嵌合体后代的技术。（五）动物性别控制与胚胎性别鉴定

性别控制通过人为干预或操作手段使母畜繁殖所需要的某一性别的后代。性别控制主要用于家畜，可通过两条途径：即X与Y精子的分离技术和胚胎性别鉴定。

1）X与Y精子的分离技术包括免疫学分离法和流式细胞分离法。前者是利用Y精子上存在雄性特异性组织相容性抗原（H-Y抗原）,利用H-Y抗体进行检测分选。后者是根据X精子和Y精子中DNA含量的差异，在流式细胞仪上分选。

2）胚胎性别鉴定指利用细胞生物学或分子生物学的方法识别胚体性状，有效控制动物后代性别比例的技术。细胞生物学方法：通过核型分析对胚体进行性别鉴定分子生物学方法：通过PCR扩增Y染色体上性别决定区的Y基因（SRY）来进行胚体性别鉴定。另外，可以通过激活卵母细胞实现孤雌生殖以及克隆技术实现家畜的性别控制。（六）胚胎冷冻保存技术

这是在冷冻细胞的基础上发展起来的，包括精子、卵母细胞和早期胚体的冷冻保存，在此只介绍胚胎的保存。短期临时保存：指将暂时不使用的胚胎在37℃培养液中保存，或在活体同种或异种动物的输卵管内保存1-2天。也可将胚胎置0-4℃低温下保存2-3天。长期冷冻保存：有仪器程序逐步降温冷冻和徒手操作的快速玻璃化冷冻。前者利用冷冻仪按编程由室温逐步降温至零下196℃（液氮）保存。所用冷冻剂一般为二甲基亚砜、氨基酸、甘油等。后者是直接加入高浓度的抗冻液（玻璃化冷冻保护液）急速冷冻，有液体转化为透明胶状固体。胚胎冷冻技术首次成功是1971年在小鼠进行的，至今该技术已逐渐完善，世界各国已相继建立起许多动物，包括人的精液库和胚胎库等，在这方面已形成一门独立的学科——冷冻生物学或低温生物学。

科学时报2004年9月28日报道：9月23日，全球首位成功进行自体卵巢再移植并自然受孕的女性，32岁的比利时妇女陶拉特顺利分娩出一个女婴。1997年，25岁的陶拉特因患淋巴癌需接受化疗和放疗，为保证今后的正常生育能力，医疗组将其卵巢组织取出，在零下196度的液氮中冷冻保存起来。6年后（2003年2月）陶拉特癌症治愈，将其冷冻卵巢移植回她的体内，4个月后恢复排卵功能，不久成功自然受孕。这种冷冻卵巢技术是源于早期的卵子冷冻技术。迄今为止，全球已有约100个左右经冷冻卵子孕育的婴儿的出生。

四、试管婴儿★1977年7月25号世界上第一例试管婴儿——路易丝.布朗在英国呱呱坠地；1978年，印度创造了世界上第二例试管婴儿。至1987年，有6000多个，1996——1997年间美国就有42463个。★我国大陆也于1988年3月10号，在北京医科大学附属第一医院妇产科手术室诞生了第一个试管婴儿——郑萌珠。★培育试管婴儿，包括体外受精（invitro

fertiliztion）和胚胎移植（embryotransfer，ET）两个步骤。即在试管中将精子与卵结合受精，2·5天后，把发育到8细胞期的胚胎移植到子宫中去，发育成长，直至足月分娩。（胚胎发育的第7—12天，即原肠化阶段，是人生最关键的时刻）。

此项技术主要适用于各种女性原因的不孕、免疫性不孕、轻度少精症等。试管婴儿的三个阶段：第一代试管婴儿：最早成功的常规技术。第二代试管婴儿：采用显微受精技术将单个精子注射进卵细胞内使其受精。适用于男性原因的不孕，如少精、弱精等。1996年，我国第二代试管婴儿（ICSI）在中山医科大学获得成功。第三代试管婴儿：对体外受精的胚胎取出细胞进行遗传学诊断后再行胚胎移植。我国第三代试管婴儿（PGD）在中山医科大学获得成功。2000年3月，我国首例超快速冷冻胚胎移植的试管婴儿在湖南医科大学人类生殖工程研究室诞生，标志着我国在该领域的研究已进入世界先进行列。进一步，美国、日本、台湾正研制多胞胎和“人造子宫”以完成怀孕全过程。五、生物克隆技术

（一）克隆概念的由来

（二）克隆研究的主要内容（三）克隆的理论基础及发展史（四）克隆的技术方法及制备程序（五）克隆技术的应用及意义（六）克隆技术存在的问题（七）惊世骇俗的计划——“克隆人”一个细菌一分为二；一根葡萄枝切成十段就可能变成十株葡萄；仙人掌切成几块，每块落地就生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐茎，一年内就能长出数百株草莓苗；人们剪下植物枝条，扦插到土里，不久就会发芽，长出新的植株，这些植株是遗传物质组成完全相同的植株，这就是“克隆”。还有将马铃薯等植物的块茎切成许多小块进行繁殖，由此而长出的后代也是“克隆”。……凡此种种，都是生物靠自身的一分为二或自身的一小部分的扩大来繁衍后代，这就是无性繁殖，无性繁殖的英文名称叫“Clone”，译音为“克隆”。（一）克隆概念的由来在动物界也有无性繁殖，不过多见于非脊椎动物，如原生动物的分裂繁殖、尾索类动物的出芽生殖等。但对于高级动物，在自然条件下，一般只能进行有性繁殖，所以要使其进行无性繁殖，科学家必须经过一系列复杂的操作程序。如用未分化的胚胎细胞进行核移植称为胚胎细胞克隆（embryoniccillcloning）；用已分化的体细胞（即非生殖细胞）。进行核移植称之体细胞克隆（somaticcellcloning）。

在本世纪50年代，科学家成功地无性繁殖出一种两栖动物—非洲爪蟾，揭开了细胞生物学的新篇章。克隆（Clone）一词源于希腊园艺学家—Klone，后来指用“嫩枝”或“插条”来繁殖生物，意思是不需生殖细胞结合的繁殖方式另一解释：源于希腊语中的clonos，意为“twig”，即嫩枝，clonizo是动词砍下嫩枝的意思。指不使用种子就可以把老树的嫩枝经插条变成幼树苗。

时至今日，"克隆"的含义已不仅仅是"无性繁殖"，凡来自一个祖先，经过无性繁殖出的一群个体，也叫"克隆"。

克隆是指从一个细胞得到的两个以上的生物体、细胞群或细胞。甚至是一段DNA的拷贝片段。

因此，在生物的分子、细胞、个体三个不同层次上，“克隆”有不同的含义。（二）克隆研究的主要内容

1供体细胞的来源和特性胚胎细胞——发育至32-64个卵裂球的胚胎细胞胚胎干细胞——来自胚胎内细胞团成年动物体细胞

其共同的特性是细胞核的全能性。

2细胞质受体的来源和特性

具有全能性的细胞核是否具有重编程的能力，主要取决于胞质的性质。成熟卵母细胞（MⅡ期）是目前公认的成功受体。3重构胚核质适应机理核质间细胞周期是否同期化、核重编程的能力如何和核质相适应的机制等。4克隆技术支持体系的研究包括供核细胞和胞质受体的采集技术和培养体系的研究；核移植操作技术及有关设备的研究。5重构胚胎的体内和体外培养技术6克隆技术的使用化研究（三）克隆的理论基础及发展史

克隆的理论基础：细胞的全能性；克隆的技术基础包括：核移植技术胚胎移植技术等。1932年，英国作家赫胥黎在他的小说《美丽新世界》中预言，人类科技发展到足以复制自身之时，便是世界陷入混乱之日。

1938年，德国胚胎学家提出动物克隆的设想：即从发育到后期的胚胎中取出细胞核，将其移植到一个卵子中去，使其繁殖。

1950年，首次在-79℃成功地冷藏牛的精于，稍后与母牛的卵子进行了人工授精。

1951年，科学家培育出第一个人体肿瘤细胞系。

1952年，皮科克医生宣称他找到了370多种不用精子生殖海胆的方法。

1952年，第一次进行动物克隆，罗伯特·布瑞格和托马斯·金对小蝌蚪的细胞核进行无性繁殖。

1953年，沃森和克里克发表了震惊世界的千字论文，揭开了生命遗传物质即DNA的双螺旋结构。

1962年，英国科学家约翰·戈德首次利用已长出腿的蝌蚪细胞进行克隆实验。

1970年，英国科学家约翰·戈德和同事利用经过培养的成年青蛙表皮细胞核克隆成功成年青蛙。

1973年，科恩和博依将外来基因插入活的有机体的实验取得突破性进展。

1976年，美国设立“重组DNA管理委员会”，负责管理人体基因工程。

1977年，数百名美国人来到美国国家科学院举行示威，其口号是：“我们不要克隆”，“不要碰我的基因”!这是第一次对生物技术提出抗议。

1978年，电影《来自巴西的男孩子》中一个假定的情节是：克隆了一群小希特勒。

1978年，由英国科学家史德彼逑和爱德华兹共同培育出第一个试管婴儿--路易斯。

1978年，大卫·罗文克在《他的影像》一书中断言人类自身可以克隆。

1981年，日内瓦大学的研究人员利用胚胎移植技术培育出正常的老鼠。

1982年，遗传工程师布林斯特培育出一只含有人体生长基因的转基因老鼠。

1983年，第一次成功地进行了人类胚胎由一个母体向另一个母体的转移。

1985年，布林斯特第一次成功地创造了第一头转基因家畜--即几头能够分泌人类生长荷尔蒙的猪。

1986年，作为人工授精试验的志愿者怀特·海德怀胎十月产下一女婴，但当她提出要抚养“自己的孩子”时，遭到了拒绝。

1986年，英国科学家首次利用胚胎细胞细胞核移植技术克隆出一头羊。

1987年，美国里根政府将有关微生物专利注册的规定，延伸到所有生物(包括动物)注册专利的规定。

1988年，格雷纳德生物公司成功地利用改进型的细胞核移植技术来克隆奶牛。

1991年，美国国家卫生与医学博物馆宣布，打算复制林肯身体组织样本。

1991年，文特尔提出要对人体大脑中发现的337个基因拥有专利保护权和所有权。

1993年，电影《株罗纪公园》“克隆”了一大堆恐龙。

1993年，人类胚胎克隆成功。

1994年，美国利用牛胚胎细胞核移植技术克隆牛成功。

1994年，中国利用山羊胚胎细胞核移植技术克隆山羊成功。

1996年，一部令人迷惑的电视动画片《蜘蛛人》创造了一个克隆蜘蛛人的英雄形象。

1997年，英国胚胎学家维尔穆特和他的同事宣称用母羊的乳腺细胞克隆成功了第一只克隆羊。开创了成年哺乳动物克隆的先河。

1998年，克隆羊“多利”当上了妈妈，生下了一只名叫“邦尼”的小羊。动物克隆研究的三个阶段

根据供核体细胞的不同和生物技术的发展，可将动物克隆研究分为三个发展阶段：

胚胎细胞克隆阶段1981年，IIImensee和Hoppe报道他们用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的内细胞团细胞作为供核体，直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞质中，重构胚体外发育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宫，获得了克隆小鼠，这是在哺乳类第一次用胚胎细胞进行核移植获得成功，1983年，美国科学家利用核移植技术结合细胞融合方法获得了克隆小鼠，1986年，英国的Willadsen用绵羊的8－16细胞阶段的胚胎细胞作供体进行核移植，首次应用电融合的方法克隆出一只小羊。此后,其他科学家也相继成功地克隆出小鼠、绵羊、牛、兔猪和猴等。我国科学家也在20世纪90年代成功开展了胚胎细胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和猪等研究。以上这些克隆实验中所用供核细胞均属发育至不同阶段的胚胎细胞。

同种体细胞克隆阶段1997年2月，英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植，成功地获得了克隆羊“多莉”。1998年5月，美国科学家Robl的研究组利用胎儿成纤维细胞克隆出了3头牛，而且携带了转移的基因。1998年7月，日本科学家Dato等用牛的输卵管细胞克隆出了8头小牛。1998年7月，美国夏威夷大学Yanagimachi领导的研究小组获得小鼠卵丘细胞进行克隆再克隆小鼠成功的结果。1999年6月，Yanagimachi的研究小组又利用成年雄性小鼠尾尖的成纤维细胞为供核体细胞成功地克隆出了一只雄性小鼠，这也是第一只供体细胞不是来源于雌性动物被克隆的动物。此后，同种体细胞克隆山羊、猪、猫和兔也都相继诞生。我国体细胞克隆山羊和克隆牛不论雌的还是雄的也都已获得成功。在同种体细胞克隆研究中。所用供核体细胞为高度分化的体细胞。

异种体细胞克隆阶段异种体细胞克隆是将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核（遗传物质）卵母细胞中。由于濒危物种的个体数量少，很难提供用于克隆的卵母细胞和代孕受体，这就促使科学家提出了异种克隆的设想。异种克隆研究面临着许多问题，如体细胞核能否在异种卵胞质中去分化并支持早期胚泡发育？异种核质能否相容？异种重构胚能否着床并进行全程发育等问题。1999年，中科院动物所实验室将成年大熊猫体细胞作为供核体细胞移植到去核（遗传生物）日本大耳白兔卵母细胞中成功地构建异种重构胚，体外培养获得孵化囊胚。2001年将重构胚移植寄母子宫，获得了着床的重大进展。2002年，不仅异种重构胚能够在异种寄母子宫中着床，而且还能发育，这是异种克隆大熊猫研究中攻克的最后一个难题中的最新进展。

明代吴承恩：《西游记》1932年赫胥黎（英国）《美丽的新世界》

1978年，美国《按照他的面貌：克隆一个人》（TheCloningofaman）。戴维.罗维克（DavidRorvik），！

神话→科幻→现实

通向“多莉”之路——哺乳动物的克隆史魏斯曼（AugustWeismann）是最初解释胚胎发育的德国科学家。中心思想是：一旦受精卵第一次分裂，形成两细胞胚胎时遗传信息便开始消减了！细胞的分化是由于通过细胞的分裂，遗传物质（基因）丢失的原因。

博韦理（TheodorBoveri）,德国细胞学家，发现马蛔虫的染色体消减现象。W.鲁（WilhelmRoux）,德国胚胎学家，金线蛙卵的针烫实验。

德里斯（Driesch），海胆卵的震荡实验。

汉斯.施佩曼（HansSpemann）德国大胚胎学家。1902年进行了蝾螈结扎实验。1928年进行了首次核移植实验。他的工作促使世界各国科学家开始了克隆动物的征程。

布里格斯（Briggs）和托马斯.金(ThomasJ.King)，美国哈佛大学。1952年进行北方豹蛙核移植实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。（用胚胎发育早期的细胞核获得克隆蛙，但利用分化细胞、种间细胞未获成功）。20世纪50年代前的工作结论：克隆胚胎细胞能发育到成体蛙，克隆成体蛙细胞能发育到蝌蚪，没有人能做出每个人都期待的关键实验——从成体蛙的细胞克隆出一只成体蛙！（分化细胞发育的局限性和种间核移植的局限性）

约翰.格登（JohnGurdon）,英国牛津大学发育生物学家。1962年利用非洲爪蟾（蝌蚪）的肠细胞核移植实验。成功的克隆出一只成体蛙。（说明已分化的细胞核进行核移植成功，打破了细胞发育的局限性）。

童第周，实验胚胎学家。1963年，从事克隆鱼的研究，证实了不同种的生物间（鲤鱼和鲫鱼）也可成功进行核移植，打破了物种之间的禁区。70年代黑斑蛙的红细胞核移植实验。1981年，我国武汉水生生物研究所的科研人员，利用肾脏细胞克隆出世界上第一条克隆鲫鱼。首次证明了成年细胞也可以去分化和再程序化，可惜当时没有得到更多的认可。1981年，瑞士日内瓦大学的卡尔伊尔门泽和美国的杰克逊实验室首瓷对小鼠进行移核实验。他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，获得核移植克隆鼠，这是首次报道克隆哺乳动物成功的例子。自开展哺乳动物的克隆以来，世界各国都作出了出色的卓有成效的工作。1984年，维拉达森（Willadson），英国剑桥大学生殖生物学家。成功的把羊的8细胞胚胎的核转移到未受精的去核卵中，得到真正的克隆哺乳动物——克隆羊。1986年，维拉达森又成功的克隆出牛。1991年，西北农业大学获得5只克隆山羊；1992年，江苏省农科院，中科院发育所、分别报道得到了“克隆兔”。

1993年，我国台湾得到5头“克隆猪”。1994年，美国科学家菲儿斯特得到了“克隆牛”。随后，我国华南师范大学、中科院畜牧所也得到“克隆牛”。

1996年，美国用核移植的办法得到了3只“克隆猴”。目前，已克隆的哺乳动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛、猴等。美国（1952年前）→英国（1963年）→中国（1970年前后）→英国

第一阶段第二阶段第三阶段动物克隆史上的丰碑——“多莉”的诞生（体细胞的克隆）

1997.2.27，英国《Nature》刊登“来自胎儿和成年乳腺细胞的成活后代”文章，报道了苏格兰爱丁堡的罗斯林（Roslin）研究所维尔穆特（Wilmut）的出色工作，实现了哺乳动物体细胞的克隆！1996.7.5，利用克隆技术培育出世界上第一只只有母亲，没有父亲的哺乳动物——“多莉”（Dolly）小绵羊诞生了。

Wilmut在克隆“多莉”时，同时做了三种细胞：来自9天的胚胎细胞；26天的胎儿分化皮肤细胞；冻存的成体（6岁）乳腺上皮细胞，都分别获得了后代。最引人注目的是6岁母羊乳腺上皮细胞的克隆成功！

移植277个乳腺上皮细胞，获得29个胚胎（桑椹期或囊胚期），移植到代孕母羊的子宫中，最后产下一只小羊——“多莉”芬多席特白面羊（6岁）苏格兰黑面羊乳腺上皮细胞（冻存3个月）卵细胞细胞核

取出细胞核去核卵

换核卵细胞体外培养代孕母羊“多莉”（白面羊的复制品）克隆绵羊“多利”没有父亲，却有三位母亲。整个克隆过程如下：首先，科学家从一只产自芬兰的6岁成年多塞特母绵羊A（“多利”的亲生母亲）的乳腺中取出一个本身并没有繁殖能力的普通细胞，将这个细胞的基因分离出来备用。然后，科学家在取出另一只母绵羊B（“多利”的借卵母亲）的未受精的卵细胞，将这个卵细胞中的基因取出，换上母绵羊B的乳腺细胞的基因，形成一个含有新遗传物质的卵细胞，再将这个基因已被“调包”的卵细胞放电激活，促使它分裂发育成胚胎。最后，当胚胎生长到一定程度时，将它植入第三只母绵羊C（“多利”的代孕母亲）的子宫中，经过正常的妊娠产下“多利”。多利完全继承了其亲生母亲――多塞特母绵羊的全部DNA基因特征，是多塞特母绵羊百分之百的“复制品”。☆Wilmut克隆“多莉”的生物学意义及几个关键问题△具有丰富的保存卵细胞和其它细胞的经验△掌握了熟练的核移植．等关键性技术△对受精卵进行了电刺激处理，起激活作用△采用细胞同步化技术，使受体和供体细胞均处在细胞周期的G0期△已经成功的进行了先期克隆实验1976年3月7日，Wilmut就在《Nature》报道了利用羊的胚胎细胞克隆出两只双生羊——麦根（Megan）和莫龙格（Moroag）‘多莉’的诞生激励各国科学家进一步研究哺乳动物的克隆问题。1997年，先后得到克隆羊、克隆牛等。

1998年7月，一组科学家（日、美、英、意）在美国檀香山宣布：他们已经用经卵泡细胞的细胞核克隆成功的小鼠“卡纽丽娜”再克隆出下一代，祖孙三代50只克隆鼠组成的大家庭具有完全一致的遗传基础。（成功率达到2%，被称为“檀香山技术”）。1998年3月，法国得到克隆牛——‘马格丽特“4月，新西兰得到克隆牛——“吉耳”5月，美国得到克隆牛——“乔治”和“查尔斯”10月，中国杜淼获胎儿成纤维细胞克隆山羊1998年底，《科学》报道德国科学家得到成年牛卵丘细胞和输卵管上皮细胞“克隆牛”。

1999年元旦刚过，在日本北海道降生了一头用耳细胞核克隆的良种奶牛。2000年1月，美籍华人杨向忠利用体外培养的公牛耳皮细胞成功克隆出6头牛犊。打破了科学界认为只有利用新鲜或短期培养的细胞才能克隆的传统观念。2000年1月，《科学》报道第一个灵长目动物——恒河猴被克隆。

2001年11月3日，我国首例健康成活的胎儿皮肤细胞克隆牛“康康”、2001年11月6日，同样用牛胎儿皮肤上皮细胞核克隆出“双双”在莱阳农学院诞生。

2002年1月18日，中国第一头本土克隆牛“委委”在曹县通过剖腹产诞生，不久死去。2002年2月11日，中科院动物所陈大元和曹县五里墩中大动物胚胎工程中心联手利用成年体细胞克隆牛群体成功。（优质成年牛的耳成纤维细胞核，共产14只，存活5头）综上所述可见：几个世纪以来人类梦寐以求的快速、大量繁殖纯种动物的夙愿，在世纪之交已变成了现实。我国科学家自1998年宣布了雄心勃勃的异种借腹克隆大熊猫的计划，目前中科院的陈大元研究员将大熊猫的体细胞核植入去核兔卵中，已成功的在体外培育出了大熊猫胚胎，进一步攻克的防线和难关是胚胎的异种着床。（四）克隆的技术方法及制备程序

主要指以细胞核移植为核心技术的无性繁殖技术。1细胞核移植技术

★概念及发展史

是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细操作技术。包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植两种。通过此技术可获得核质杂种。利用核移植技术，可以研究胚胎发育过程中细胞核和细胞质的功能及相互作用关系；探索有关遗传、发育和细胞分化等方面的理论等问题，后来才将此技术应用于克隆。1928年，德国胚胎学家施佩曼（HansSpemann）第一个提出细胞核移植的设想并进行了首次核移植实验的尝试。他的工作促使世界各国科学家开始了克隆动物的征程。

1952年，布里格斯（Briggs）和托马斯.金(ThomasJ.King)，美国哈佛大学。进行北方豹蛙核移植实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。（用胚胎发育早期的细胞核获得克隆蛙，但利用分化细胞、种间细胞未获成功）。1958-1962年间，英国剑桥大学利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育非洲爪蟾。1977年，开始在小鼠进行哺乳动物的核移植，并先后取得了突破性进展。我国的核移植实验开始于20世纪50年代。著名科学家童第周先后在两栖类和鱼类做出了在世界上极有影响的工作，特别是他同牛满江合作，实现了不同种间的核移植，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”。（鲫鱼核→鲤鱼去核卵中）2细胞核移植的技术要点核移植的众多工作为后来的动物克隆打下了良好的基础。下面简要说明细胞核移植的技术要点：

（1）受体体细胞的准备受体为成熟的卵细胞。采用机械法（剥离）或化学法（胰蛋白酶）去卵膜，然后用玻璃微针挑出细胞核或紫外线照射使核物质分解以达到去核的目的。

（2）供体细胞的准备供体通常选用：胚胎细胞——发育至32-64个卵裂球的胚胎细胞胚胎干细胞——来自胚胎内细胞团成年动物体细胞其共同的特性是细胞核具有全能性。（3）移核

选择合适的微吸管穿过透明带注入去核卵母细胞中，避免移入过多的细胞质、控制温度，短时间内完成。还可用供核细胞和卵母细胞的融合实现核转移。

（4）融合和激活

融合是指用某种方法使核与胞质融为一体的过程；激活是通过某种刺激使卵子内钙离子浓度升高，给卵一个启动信号，促使细胞周期的恢复。3克隆动物的制备程序核供体动物的选择与细胞核的获得核受体动物的选择与细胞核的移出供体核的移入及原核的取出胚泡的体外试管培养代母的选择与胚泡移入子宫克隆动物的体内发育与出生根据细胞核的来源不同，一般分为胚胎细胞核移植法、胚胎干细胞移植法、胎儿成纤维细胞移植法和体细胞核移植法，其基本程序大体一致。1）胚胎细胞核移植法将未着床的早期胚胎分散成单个细胞，然后分别取核进行核移植，发育成胚胎后再行胚胎移植、发育分娩。也可通过细胞融合法将供体核移入去核卵的方法。2）胚胎干细胞移植首先制作胚胎干细胞系，再进行细胞核移植，可克隆出更多的动物个体。此法在小鼠较为成熟。3）胎儿成纤维细胞核移植从早期胎儿分离成纤维细胞进行核移植。1998年5月，美国科学家Robl的研究组利用胎儿成纤维细胞克隆出了3头牛，而且携带了转移的基因。

4）体细胞克隆技术1997年2月，英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植，成功地获得了克隆羊“多莉”。荣登Science杂志评出的1997年世界十大科技成就之首。芬多席特白面羊（6岁）苏格兰黑面羊乳腺上皮细胞（冻存3个月）卵细胞细胞核

取出细胞核去核卵

换核卵细胞体外培养代孕母羊“多莉”（白面羊的复制品）

☆遗传素质完全一致的克隆动物将有利于开展对动物（人）生长发育、衰老和疾病健康等机理的研究☆拯救濒临灭绝的动物（异种克隆、借腹怀胎），保护基因资源☆大量快速扩大和繁殖高经济性状（品质优良）的牲畜（禽）☆克隆转基因动物，创建活的药厂，提供廉价的药品和保健品☆提高临床医学的治疗手段（提供易被接受的移植器官）☆解决不育症，作为生育的辅助措施——“克隆人”☆DNA大量拷贝（DNA克隆）（五）克隆技术的实践应用及意义动物克隆的广泛开展，进一步验证了细胞的全能性

克隆技术最重要的用途体现在两方面：一是大规模繁殖良种动物，包括转基因动物；二是克隆濒危动物。前者，可生产基因药物。伊恩·威尔莫特在克隆多利之前，先从英国PPL基因工程公司得到了一批转基因羊，这种羊的基因中带有人体的一个功能性基因，并在母羊的乳腺中表达出来。克隆濒危动物，最典型的例子就是大熊猫。现在大熊猫总数只有1000头左右，因其数量非常有限，因此用大熊猫的卵细胞克隆不现实。有科学家提出了“异体克隆”，即大熊猫的体细胞和兔子的卵细胞克隆，但这项工作目前进行得比较艰难，国内科学家正努力将这一研究进行下去。（六）克隆技术存在的问题（克隆留给我们的思考）

☆技术尚不成熟，成本高、效率及成活率低

移植434只成体绵羊的乳腺上皮细胞核至相同数量的绵羊卵子中，产生了277个融合细胞（成功率为63.8%）。

将此融合细胞移入母羊输卵管成功247个（89.2%），只获得29个发育到桑椹期或囊胚期的胚胎11.7%）。

移植到13只代孕母羊的子宫中，仅有一头羊怀胎（7.7%）最后产下一只小羊——“多莉”(总成功率为0.23%)。☆存在严重的生理或免疫缺陷

☆克隆动物的寿命问题，克隆动物存在严重的早衰问题，夭折率高达75%。（多莉DNA遭损伤，明显衰老，端粒比同龄羊缩短约20%，与6岁供体核母羊相似）

关于克隆动物是否早衰的争论大体分两派，一派认为，克隆动物的端粒比较短，克隆动物的基因不正常，克隆动物早衰是一个根本现象。另一派则认为，克隆动物的遗传物质是正常的，目前发现的早衰迹象是在克隆过程中出现的一些技术问题造成的，或者克隆动物在发育中出现了变异，早衰只是属偶然现象，也许有的变异使得克隆动物更加长寿。不过由于目前全世界的克隆动物较少，诞生时间都不很长，因此到目前为止这一问题尚未有定论。“多利的早死，早就预料到了”

2003年2月14日，培育出多利的英国苏格兰罗斯林研究所发表新闻公报说，由于兽医检查发现多利患有进行性肺病，研究人员对它实施了“安乐死”。进行性疾病系指症状不断加重、状况不断恶化的疾病。“多利的早死，早就预料到了！”专家们如是说。生物寿命由基因密码决定，但多利是通过体细胞移植进行无性繁殖的产物，其基因是一成不变的。比如，一个人自然寿命是120年，如果拿一个50岁的人的体细胞克隆，其后代的自然寿命就会减去50岁而缩短到70年。多利3岁时做了一次基因组检测，发现染色体端粒长度比正常羊短20％，而端粒缩短是衰老的标志。根据染色体长度推算下来，多利3岁时的衰老程度与其“代理母亲”9岁时一样。此外，在进行克隆操作的时候，基因会不可避免地受到损伤，这就导致克隆动物免疫上的先天缺陷。基于这样的分析，专家认为多利的早死是必然的。

☆克隆动物和原来一样吗（是否是完全的复制？）

☆受体细胞的选择问题（卵细胞以外的细胞可以吗？）

☆恐龙可以被克隆吗？（恐龙细胞核、卵、代孕母亲）

☆社会学、伦理学问题——克隆人

1克隆人争论的由来

2克隆人可能吗？

3能克隆出一个正常人吗？

4克隆人的社会地位（处境）如何？

5世界各国的态度及我国立场

（七）惊世骇俗的计划——“克隆人”1997年克隆绵羊“多莉”后引发出的对克隆人的思考和顾虑，并激起了各国政府的强烈反响。自从2003年邪教组织雷尔教派的科学家布里吉特·布瓦瑟利耶声称已“培育出世界第一个克隆婴儿”后，国际舆论一直沸沸扬扬，科学界则始终持质疑的态度。然而，由此引发的“克隆人”热却至今温度不减。多数西方国家政府，领袖以及宗教界人士纷纷发表声明反对克隆人，也有不少国家制定了禁止克隆人的法令。在这种情况下，依然在国际社会还有人要进行克隆人。如意大利妇科专家安蒂诺利，美国专家扎沃斯，还有在美国的法国女科学家布利吉特，布瓦瑟利耶。她在2002年12月27日于美国佛罗里达州宣布“26日世界上第一个‘克隆人’诞生了”，除了人们的震惊外，紧接着是一片质疑和反对声。1998年新年伊始，美国一位物理学家公开向新闻媒体宣布了他自己辉煌的“克隆人”计划。此人名叫理查德.锡德，70岁，哈佛大学教授，

意大利胚胎学家安蒂诺里和美国一女科学家，已经征集了200多位女性在公海的一只游船上进行克隆人的试验。

英国和韩国已于1998年用人的体细胞克隆成功人的胚胎，由于法律约束又销毁了。

维尔穆特1999年月初在英国宣布他领导的科研小组正着手实施克隆人体胚胎的计划。

1999年6月，美国马萨诸州成功克隆出人的胚胎。2001年11月25日美国先进细胞技术公司（ACT）报道了利用克隆技术培育出人类早期胚胎（4、6细胞期），这个消息一瞬间就传遍了世界，在全球引发轩然大波，激起了各国争议，因为它离克隆人只有一步之遥。因为构建成的胚胎只要移入妇女子宫，就有可能发育成个体（即克隆人），它比治疗性克隆技术的复杂程序要简单得多。因此，人们十分担心，少数人在经济利益的诱惑下，很难保证他们不越轨而硬闯克隆人的禁区。我们一定要采取措施给予制止。三位“疯子科学家”执意要开始克隆人

美国“克隆基金”主任布瓦瑟利耶、肯塔基州列克星顿大学激素学院院长扎沃斯和意大利科学家安提诺里。是克隆人的坚定推崇者，因此被学术界称为“科学疯子”。三位“疯子科学家”最近在美国科学院的研讨会上暗示，他们最近几周将开始实施克隆人的计划，克隆人可能明年就会问世。由于三人大肆鼓吹其克隆人计划，结果招致了美国国家科学院大厅内的一场对骂。安蒂诺里已经建立了克隆人实验室，并准备从2002年11月开始实施克隆计划，其对象是200对渴望得到孩子的不育夫妇。通过在多只山羊、老鼠身上的试验，他相信自己已经熟练地掌握了“再克隆”技术，并完全能够避免畸形婴儿的出现。“再克隆”是从胚胎中取出一个健康的细胞，然后再将克隆过程重复一次。安蒂诺里说：“我的技术不是克隆，而是再克隆。我不会制造婴儿父母的‘复制品’，我的目标是要造出完美的婴儿”。塞韦里诺·安蒂诺里极具争议的意大利科学家塞韦里诺·安蒂诺里在罗马宣布，他已经对克隆技