川芎及川芎中的活血作用成分对术后去负荷大鼠比目鱼肌萎缩的影响

川芎及川芎中的活血作用成分对术后去负荷大鼠比目鱼肌萎缩的影响

根据大量临床数据和动物实验，在废弃（不活跃、睡眠不良、航空航天等）状态下大约10天，骨训会明显减少。因此,寻找有效的预防和治疗废用性肌萎缩药物,是临床医学、运动医学、康复医学及航天医学等领域亟待解决的重要课题之一。肌梭是骨骼肌中一种感受肌肉长度变化或牵拉刺激的梭形感受器,梭内肌纤维可分为核袋与核链纤维两种,核袋纤维(nuclearbagfiber)较长、体积较大,赤道区有一膨大,内含许多核故称核袋,其代谢特点类似慢肌,属氧化型纤维,核袋纤维又可分为核袋1(典型氧化型)和核袋2纤维(氧化酵解混合型),核袋1纤维是最长的梭内肌纤维,核袋2纤维是最粗的梭内肌纤维;.核链纤维(Nuclearchainfibre)较短、体积较小,因细胞核沿肌纤维中轴排成链状而得名,其代谢特点类似快肌,属酵解型纤维。有研究表明,废用状态下的骨骼肌,由于肌梭的适宜刺激减少或消失,传入中枢的冲动减少,肌梭的结构与功能发生了退行性改变,能够兴奋肌梭的对抗性措施如间歇性伸展可延缓骨骼肌的废用性萎缩。骨骼肌废用会引起血液方面的问题,如毛细血管内血栓形成增加、微循环受损等可能进一步加剧了肌肉的萎缩。因此,我们认为能兴奋肌梭的活血类药物极有可能成为抗废用性肌萎缩的理想药物。我们课题组的先期研究已经初步证实了能够兴奋肌梭的活血类药物川芎嗪、川芎、当归等能不同程度地对抗大鼠比目鱼肌的废用性萎缩,但这些药物中抗肌萎缩的药效成分及药效作用却无人涉及。本研究主要对前期筛选出的川芎及川芎中起活血作用的两种主要药效成分(阿魏酸钠与川芎嗪)对废用性肌萎缩的影响进行了比较研究,以探讨川芎中抗肌萎缩的主要药效成分及药效作用,并从梭内、外肌纤维MHCII型的表达水平和血液流变学角度对其抗废用性肌萎缩的机制进行了初步探讨。1方法1.1不同剂量组的剂量对主客观的影响SD成年雌性大鼠42只(西安交通大学医学院实验动物中心提供),体重200～235g。大鼠按体重配对原则随机分为7组(n=6):正常对照组(CON),后肢去负荷组(HLU+W),川芎煎剂组(HLU+Lig),阿魏酸钠高剂量组(HLU+SfH),阿魏酸钠低剂量组(HLU+SfL),川芎嗪高剂量组(HLU+TmpH)和川芎嗪低剂量组(HLU+TmpL)。正常大鼠单笼饲养;每日清晨后肢去负荷组按10ml/kgbw的剂量用溶媒灌胃;川芎煎剂组按1g·10ml/kgbw的剂量用川芎煎剂灌胃;阿魏酸钠与川芎嗪的高、低剂量组分别以60mg·10ml/kgbw和30mg·10ml/kgbw的剂量用阿魏酸钠与川芎嗪灌胃。川芎剂量的确定参照中国药典,选取中等剂量作为川芎煎剂组;阿魏酸钠和川芎嗪的剂量确定参照各药品的说明书,在临床用药的范围内选取有一定梯度的两个剂量作为高、低剂量组。1.2药品、药品与药品川芎煎剂的制备:生药在蒸馏水中浸泡30min后中火煎1h,煎液用纱布过滤,同样方法再次煎药30min后过滤,两次滤液合并,浓缩至适当的剂量,放置于4℃冰箱中保存。川芎生药采购于西安市怡康医药超市。磷酸川芎嗪和阿魏酸钠为商业上通用药品。磷酸川芎嗪(Ligustrazinephosphatetablets),北京燕京药业有限公司,批准文号:国药准字H11021964。阿魏酸钠(Sodiumferulatetablets),成都亨达药业有限公司,批准文号:国药准字H51023583。1.3悬吊笼的饲养大鼠尾部悬吊14天,用医用胶布粘贴于大鼠干净尾部的后半部,固定尾部,胶布另一头连接在悬吊笼顶部可360°旋转的转接环上,保持大鼠身体与水平面呈30°,前肢着地自由活动,自由饮食饮水。大鼠单笼饲养,悬吊笼宽30cm、长35cm、高45cm,四壁为有机玻璃。饲养室室温20～25℃,人工控制室内照明,每昼夜均保持12h光照与黑暗的循环交替。1.4组织切片的制备肌肉样品的制备:动物经3%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔麻醉后解剖,迅速取出左后肢比目鱼肌,电子天平(Sartorius,BS210S,德国)称重、记录(精确到0.1mg),然后取比目鱼肌中段约5mm,投入4%的多聚甲醛中固定12h,接着转移样品到30%的蔗糖溶液中静置3h,用O.C.T包埋剂(Tissue-Tek○R,美国)于适当的温度下垂直包埋组织块,在零下25℃的冰冻切片机(Leica,CM1850,Wetzlar,德国)中以10μm的厚度连续切片,组织切片粘贴在用多聚赖氨酸(10g/L)处理过的载玻片上。血液样品的制备:将麻醉后的大鼠胸腔打开,从心脏取血约5ml,放入肝素抗凝试管中,轻轻摇动使血液与肝素充分混合。1.5比目鱼肌的制备使用抗快肌纤维的抗体MY32(Boster,BM0096,武汉,中国),以免疫组织化学的方法分析肌纤维MHCII型表达的变化。将组织切片用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的山羊血清于37℃封闭30min;滴加一抗,切片于37°C下孵育2h,PBS冲洗3～5min;滴加二抗后37℃下孵育1h,PBS冲洗3～5min;滴加SABC(SABC试剂盒,Boster,SA2001,武汉,中国)后37℃下孵育30min;用氨基联苯胺(DAB)染色;经过酒精脱水和二甲苯透明后,用树胶封片,观察显色反应。比目鱼肌I型和II型肌纤维的比例可以以一种肌纤维个数与总肌纤维个数的比例表示,对一个区域内的肌纤维进行统计。肌纤维横截面积的测量(每种肌纤维个数不小于100个)采用Motic系统(MoticImagesPlus2.0)进行统计。1.6红细胞压积测定将样品血液加入到1ml的压积管中,以3000r/min离心30min,记录红细胞压积数值。另取血样0.8ml,用粘度计(YDA-IV(C),北京,中国)测量高、中、低三个切变率下的全血粘度,剩余血样同理离心后取血浆0.8ml,测定血浆粘度。1.7单因素方差分析及组间分析用统计软件SPSS10.0对所有数据进行分析统计,所有结果均用平均值±标准差(x¯±s)的方式表达。进行单因素方差分析(ANOVA)后,用Student-Newman-Keul检验进行组间分析。方差不齐时,运用ANOVA-Dunnett’sT3的方法进行分析。2结果2.1术后去负荷导致大鼠体重下降14天造模过程中,正常对照组体重增幅最大,各造模组大鼠体重在初期均有一定的下降,从第5天起体重逐渐增加,造模结束时体重接近或超过造模前体重,各组大鼠体重无明显差异(P>0.05)。与正常对照组相比,14天后肢去负荷导致比目鱼肌湿重和肌重体重比分别下降了49.8%和50.9%(P<0.01);各灌药组使后肢去负荷大鼠比目鱼肌湿重和肌重体重比有一定程度的增加,但均无显著性差异(表1)。2.2阿魏酸钠对iii型肌纤维横截面积的影响14天后肢去负荷,使大鼠比目鱼肌肌纤维横截面积与正常组相比发生了极其显著的下降(P<0.01)。与后肢去负荷组相比,高剂量的阿魏酸钠和川芎嗪分别使I型肌纤维横截面积增加了37.3%和39.4%(P<0.05),使II型肌纤维横截面积分别增加了45.2%和42.4%(P<0.01);同时,阿魏酸钠低剂量组使II型肌纤维横截面积增加了29.8%(P<0.05)。其余各组对I型和II型肌纤维横截面积无明显影响(P>0.05,图1)。2.3mhciii型的表达水平根据MHC表达水平的不同,比目鱼肌肌纤维可分为两种类型,I型(阴性)与II型(阳性)肌纤维。14天后肢去负荷使比目鱼肌肌纤维MHCII型的表达水平比正常对照组增加了22.6%(P<0.01);川芎煎剂组能有效抑制后肢去负荷所引起的肌纤维MHCII型表达的增加(P<0.01),其余各灌药组的抑制作用更加显著(P<0.01),高、低剂量组的阿魏酸钠和川芎嗪均使肌纤维MHCII型的表达水平接近于正常对照组(P<0.01,图2)。2.4核链纤维的阴性反应正常对照组比目鱼肌肌梭内核袋1纤维的MHCII的表达呈阴性,核袋2纤维呈阴性或弱阳性,核链纤维大多呈阳性,但也有少量肌梭中有一条核链纤维的MHCII表达呈阴性;与正常对照组相比,后肢去负荷使核袋2纤维MHCII的阳性表达个数明显增加,核链纤维的MHCII表达则完全转变为阳性,核袋1纤维的阴性反应不变;川芎及其两种主要药效成分使后肢去负荷大鼠核袋2纤维MHCII的阳性表达转变为阴性,对核链纤维MHCII的表达水平无明显影响(图3)。2.5灌药对小鼠血浆粘度的影响与正常对照组相比,14天后肢去负荷使三个切变率下的全血粘度均不同程度地升高,其中低切变率下的全血粘度增加了29.1%(P<0.01),血浆粘度增加了1.8%,红细胞压积降低了5.1%,但均无显著性差异;各灌药组能降低后肢去负荷大鼠在三个切变率下的全血粘度,其中对低切变率下全血粘度降低的作用最为明显(P<0.01,图4);高剂量的阿魏酸钠和川芎嗪能抑制血浆粘度升高和红细胞压积降低的趋势(图2)。3药品中抗废用活性成分的筛选废用条件下,骨骼肌的形态、功能和能量代谢类型都会发生一定的变化。出现肌肉重量减轻、肌纤维横截面积减少,肌肉收缩强度和力量降低等肌肉萎缩症状,且抗重力肌较非抗重力肌萎缩程度大。根据收缩特性与代谢类型的不同,骨骼肌可分为慢肌与快肌两种,慢肌以I型肌纤维为主,主要通过有氧氧化获取能量,快肌中II型肌纤维较多,主要通过糖酵解途径代谢。研究证实,慢肌肌纤维的肌球蛋白重链(MHC)主要为I型,快肌肌纤维的MHC主要为II型,比目鱼肌是典型的抗重力肌(慢肌),废用条件下,其肌纤维MHCII型的比例会明显增加,I型肌纤维比例明显减少,出现I型(氧化型)向II型(酵解型)肌纤维的转化。实验中,14天后肢去负荷使大鼠比目鱼肌湿重、肌重体重比、肌纤维横截面积均明显降低,且梭外肌纤维MHCII型的表达水平显著升高,出现I型向II型肌纤维的转化,说明后肢去负荷使大鼠比目鱼肌发生了明显萎缩。川芎中含有多种有效成分,其中阿魏酸钠与川芎嗪具有抗血小板聚集、舒张血管、增加冠状血管血流量等作用,是川芎中起活血作用的主要药效成分。本实验中川芎及其两种主要药效成分均能抑制废用引起的梭外肌纤维MHCII型表达水平的升高,高剂量的阿魏酸钠和川芎嗪还能对抗废用引起的I型与II型肌纤维横截面积的减小,且低剂量的阿魏酸钠也能对抗废用引起的II型肌纤维横截面积的减小,显然,阿魏酸钠和川芎嗪对抗废用性肌萎缩的药效优于川芎,以阿魏酸钠尤为突出。这一结果提示,川芎中抗废用性肌萎缩的主要有效成分可能是其中起活血作用的药效成分阿魏酸钠和川芎嗪,且这两种药物在被选作抗肌萎缩药物时,应选用较高剂量方能奏效。前已述及,骨骼肌废用会引起毛细血管内血栓形成增加、微循环受损以及血粘度升高等血液方面的问题。本实验中,后肢去负荷14天使大鼠在低切变率下全血粘度明显升高,feiyon三种药物均能显著降低后肢去负荷大鼠的全血粘度;且高剂量的阿魏酸钠和川芎嗪还能抑制废用引起的血浆粘度升高和红细胞压积降低趋势。显然,三种药物的活血化瘀作用有效地改善了废用骨骼肌的血液灌注,协同其对红细胞压积的提升作用,提高了血液的运氧能力、改善了骨骼肌的血供,从而抑制了废用条件下肌纤维代谢类型从有氧氧化型(I)向糖酵解类型(II)的转变,抑制了II型肌纤维比例的明显升高,这可能是川芎及其两种主要药效成分阿魏酸钠和川芎嗪对抗废用性肌萎缩的重要机制之一。另一方面,实验显示,后肢去负荷14天会引起梭内肌纤维MHCII的阳性表达增多,出现类似梭外肌的I型向