生物医学传感与检测原理 课件 第7、8章 生物医学中的化学传感与检测、生物标志物的传感检测新技术

生物医学中的化学传感与检测教育部生物医学工程类专业教学指导委员会“十三五”规划教材生物医学传感与检测原理第七章01生理与代谢的生物化学过程生命活动的生物化学反应概述新陈代谢是生命现象的基本活动，生物体一方面从外界环境摄取各种营养物质，经过转化提供身体所需的原料和能量，同时体内形成的分解产物要排出体外，维持物质成分的动态平衡。在新陈代谢过程中，体内各种物质的合成、分解、转化、利用等，在大多数情况下是各种生物分子在水溶液中进行的系列化学反应。生理与代谢的生物化学过程生命过程所表现出的细胞、组织、器官生理活动，与新陈代谢的物质、能量转换密切相关，特别是血液循环系统、消化系统、呼吸系统及肾脏在物质传送和交换中发挥了重要作用。其中，由心脏和血管组成的循环系统主要完成体内物质运输，运输代谢原料和代谢产物，使机体新陈代谢持续进行；体内各内分泌腺分泌的激素或其他体液，通过血液运输到达靶细胞，实现机体体液调节。生理与代谢的生物化学过程虽然身体内环境稳定的维持最终取决于消化、呼吸、循环、排泄等诸多内脏器官或系统，但血液本身有重要作用，主要包括：机体细胞与组织液进行物质交换需要依靠血液在组织液与各内脏器官之间运输各种物质；血液对内环境某些理化性质的变化有一定的“缓冲”作用，如减轻代谢产物引起的pH值变化，吸收大量的热抑制温度快速升高；通过与毛细血管外的组织液进行物质交换可以反映内环境理化性质的微小变化，再刺激感受器为调节系统提供反馈信息。生理与代谢的生物化学过程作为最基本的生命单元，细胞由细胞膜、细胞质、细胞核三部分构成，其中细胞膜在新陈代谢和物质交换中有重要意义。一方面，细胞膜使得细胞能够独立于环境而存在，通过细胞膜与周围环境进行的选择性物质交换而维持生命活动；另一方面，细胞在不断进行新陈代谢的过程中需要从外界获得氧和营养物质，排出代谢产物，这都需要通过细胞膜的脂质双分子层、细胞膜蛋白和糖类等进行调控。生理与代谢的生物化学过程02化学传感与检测原理电化学基本概念以电化学反应为基础的测量系统主要包括三个组成部分：电解质溶液、电极（至少两个）和测量电路。电解质溶液是位于一个连通的容器内的电极间媒介，是离子导体，主要由溶剂和高浓度电离盐及电活性物质组成。电极是电化学传感器中最主要的敏感器件，是电化学反应进行的场所；一个电极系统由一个电子导体相和一个离子导体相组成，且在两相界面有电荷转移发生，该电荷转移反应就是电极反应，也就是电化学反应。电化学反应过程与电解质溶液活度、溶液电导率、电极电势、溶液电势等多种因素密切相关。活度在水溶液中，认为强电解质全部离解，弱电解质部分离解，并建立平衡。但由于电解质溶液中电离的正、负离子之间以及离子与溶剂分子之间的相互作用，使得物质的浓度不能代表其在溶液中的有效浓度。因此引入活度（activity）来表示电解质溶液中物质的有效浓度。溶液电导率溶液中的电导率是指单位立方厘米体积的电解质溶液的电导。对于一横截面积为A、两个电极间的距离为1的电解池。电化学基本概念双电层模型当金属电极浸入电解质溶液中时，金属与溶液的界面上将产生反应，一部分金属离子将离开金属表面进入溶液中。金属因失去金属离子而带负电荷，溶液中因有金属离子的进入而带正电荷。电极电位与能斯特方程单个电极的电极电位无法测量，通常与一个选定的作为标准的电极（参比电极）组成一个化学电池，通过测量两电极之间的电位差来获得电极电位。能斯特方程用来表示电极的电极电位或电池的电动势与待测物活度间的关系。电化学基本概念电解池与原电池电化学分析方法是基于化学能与电能的相互转化，主要有原电池和电解池两种测量体系。当外加电源的正、负极分别与电解质溶液中的两个电极相连时，就构成了电解池。电化学传感器测量系统电化学传感器的测量体系主要由电极、电解质溶液和测量电路构成，其中电解质溶液是待测样品。电极是电化学传感器中将生物化学信号转换为电信号的换能器的重要组成部分。电化学基本概念对电极又称辅助电极，不参与电化学反应，与工作电极构成串联回路，起到电子传递、为工作电极提供所需电流的作用。对电极（counterelectrode）参比电极是一个已知电势的不极化电极，它为测量提供标准电位。参比电极（referenceelectrode）电化学基本概念工作电极是发生所需反应的场所，同时也是固定识别元件的载体。工作电极（workingelectrode）离子传感器离子选择性电极离子选择性电极是一类利用膜电势测定溶液中离子活度的电化学传感器。此类电极表面具有一层敏感膜，可以对溶液中的待测离子产生选择性的响应。当电极与含待测离子的溶液接触时，敏感膜和溶液的界面上会产生与该离子活度直接有关的膜电势。离子敏感场效应管离子敏感场效应管（IonSelectiveFieldEffectTransistor，ISFET）是一种新型离子敏感器件，它基于调制栅极电压来调节源极与漏极之间电流的原理，在绝缘栅上沉积离子选择性敏感膜，由离子浓度影响漏电流来进行测量。离子传感器气体传感器电化学气体传感器电化学气体传感器的检测原理是：待测气体在电极和电解质组成的电池中与电解质发生反应，或在电极表面发生氧化还原反应，在两个电极之间形成电压或电流，通过测量电压或电流即可得到待测气体的浓度。根据测量电化学参数的不同，电化学气体传感器可分为两类：电位型和电流型。气体传感器半导体气体传感器当半导体材料吸附某些气体分子时，将产生电子迁移而使表面电导、表面势垒或体电导发生变化，由此测定气体浓度。气敏半导体器件具有灵敏度高、成本低、寿命长、结构简单等优点。半导体气体传感器可大致分为电阻型和非电阻型。表面电阻控制型半导体气体传感器：此类传感器利用表面电阻变化来检测气体。体电阻控制型半导体气体传感器：此类传感器利用体电阻变化来检测气体。非电阻型半导体气体传感器：结型半导体元件，如金属半导体二极管、金属氧化物半导体二极管以及MOSFET等。气体传感器03生物敏感膜电化学传感与检测用于生物传感的生物敏感膜根据选材不同，有酶膜、全细胞膜、组织膜等。生物敏感膜按识别原理可分为生物催化反应型、生物吸附型。要让酶等生物活性物质应用到生物传感的敏感膜中，必须让其固定在各种载体上，这种结合称为固定化技术，而固定化技术的目标是形成稳定、可重复使用、能直接进行底物分析、操作简单的实用化敏感膜。生物敏感膜的固定化技术将生物活性材料封闭在双层滤膜之间。夹心法采用水溶性载体物理吸附或静电结合，使蛋白分子固定。吸附法将酶或细胞包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构基质中。包埋法生物敏感膜的固定化技术使生物活性分子通过共价键与不溶性载体结合而固定，也称载体结合法。共价连接法利用双功能试剂在分子间形成交联而聚成网状结构。交联法LB（Langmuir-Blodgett）膜技术。膜技术生物敏感膜的固定化技术葡萄糖酶电极葡萄糖酶电极基本上由酶膜和Clark氧电极或过氧化氢电极组成。乳酸酶电极传感器乳酸酶电极传感器的生物敏感活性材料是乳酸氧化酶。酶传感器细胞是最基本的生命活动单元，利用细胞本身具有的对被分析物敏感的受体、离子通道和酶等作为感受被分析物的敏感元件，是生物传感器发展的新方向，于是出现了将整个细胞或组织作为敏感元件，通过测量细胞的生理生化参数的变化来获得细胞响应信号的生物传感器。生物组织与细胞传感器生物组织与细胞传感器组织传感器组织传感器也称组织电极，它是以动植物组织薄片材料作为生物敏感膜的生物传感器，主要利用生物组织中的酶作为反应催化剂，故其工作原理和结构与酶电极相似，但具有诸多优点。组织电极中酶的活性比酶电极所用的离析酶活性高；组织电极酶的稳定性高；生物材料更容易获取；可替代昂贵的酶试剂；制作简单，无须特别固化。生物组织与细胞传感器组织电极一般选择酶活性高、含量丰富的组织；同时，要综合考虑切片厚度，切片薄可以使电极响应速度快，但膜内酶含量少，厚度以0.3~0.5mm为宜。组织电极的传感元件多采用气敏电极，主要是利用其选择性好的特点，可避免测量过程中金属离子及某些有机分子的干扰。生物组织与细胞传感器生物组织与细胞传感器图7-17是以NH，电极为传感元件的动物组织电极示意图。生物组织与细胞传感器细胞传感器随着技术发展，以细胞为生物敏感材料的传感检测技术正不断出现，从传统的以生物酶为基础的检测方法逐步发展到以细胞生理、代谢过程进行检测，出现了基于细胞代谢、细胞阻抗和细胞电生理的生物传感检测技术。1）细胞代谢传感器测量细胞代谢过程中细胞及细胞外微环境的相关参数，可以间接反映细胞的生理状态变化。20世纪90年代，出现了一种基于光寻址电位传感器（Light-addressablePotentiometricSensor，LAPS）的细胞微生理计，通过检测细胞外微环境的pH值变化，定量计算细胞质子排出速率，从而可以分析细胞的代谢率。生物组织与细胞传感器生物组织与细胞传感器图7-18是一种基于细胞外pH值测量的细胞微生理计的结构原理示意图。2）细胞阻抗传感器培养在基质上的细胞，其黏附、伸展、增殖、凋亡等生理与病理变化过程，将表现在细胞的电阻变化、膜电容变化，以及细胞层-基底膜空间变化上。细胞阻抗传感技术通过微安级的电流测量，可以实时、量化监测贴壁细胞迁移过程中细胞形态的变化及其生理状态。生物组织与细胞传感器生物组织与细胞传感器图7-19是一种细胞阻抗传感器原理示意图。微生物传感器微生物是与日常生活紧密相关的微小生物群落，存在于我们身体内外的微生物群几乎构建了一种人眼看不见的生态环境，微生物及其群落状态在很大程度上能反映人的生理环境和生命活动过程，因此，微生物也被作为一种选择性生物活性材料应用在生物医学传感检测中。微生物传感器典型的微生物传感器就是微生物电极，是酶电极的衍生型电极，其结构和工作原理与酶电极类似，也有电流型和电位型两大类。微生物作为敏感膜材料与底物作用一般有两种情况：对好氧性微生物，与底物作用的同时，其细胞呼吸活性增强，耗氧量增加，用氧电极或CO电极测定其呼吸活性，便可求出底物浓度；对厌氧性微生物，在同化被测有机物后将生成各种代谢产物，如CO，、H，、H、甲醛等，可利用相应的离子选择性电极测量代谢产物浓度，进而获得底物浓度。微生物传感器图7-20（a）是一种呼吸活性测定型微生物传感器。微生物传感器图7-20（b）是一种由微生物膜和燃料电池组成的传感器。酶和微生物主要以低分子有机化合物作为测定对象，对高分子有机化合物，则可以利用抗体对抗原的识别和结合功能，构建对蛋白质、多糖类等高分子有高选择性的免疫传感器。电化学免疫传感器是由免疫分子识别系统和电化学转换器组合而成的，是一种将电化学分析与免疫测量相结合的技术。通常可分为直接型（非标记）免疫传感器和间接型（有标记）免疫传感器。电化学免疫传感器04化学与生物传感的医学检测应用电解质分析仪人体液是个巨大的缓冲液体系，体液中的各种离子的动态平衡对维持细胞的渗透压和人体正常机能十分重要。当体内电解质出现紊乱时将会对人体的各种器官和代谢功能产生损害。因此，电解质分析仪在临床检验中的广泛利用已经成为评价人体液环境的重要工具之一。血液样品检测血气分析仪呼吸是新陈代谢的重要部分，是机体对O，的摄取和消耗以及产生CO，的过程。人体血液中O，和CO，的含量，以及酸碱程度是反映人体代谢状态的重要指标。血气分析仪是通过测定人血液pH值以及所含O，和CO，的浓度来评价患者的酸碱平衡、呼吸及代谢功能等，广泛应用于危重病人抢救、麻醉、体外循环及神经外科手术中。血液样品检测连续性监测经皮氧监测由于气体较其他物质更容易透过皮肤，因此可以在体表放置传感器检测皮下组织内的气体分压。经皮测量血液中的气体分压时，需要对皮肤加热使末梢血管扩张，提高气体透过表皮的通透性。由于皮肤的耗氧量及二氧化碳的生成量远低于经皮输送的气体，故在皮肤加热极度充血情况下皮肤组织内气体分压近似为动脉血分压。连续性监测胰岛素泵的血糖动态监测糖尿病是一种以高血糖浓度为特征的常见慢性病。长期的高血糖将会导致人体各种组织，如心脏、血管等的病变和功能损害，严重威胁人们的健康。因此，对血糖的动态连续监测对于了解糖尿病人的血糖波动，进行血糖的精细化管理和实现个性化诊疗十分重要。生物标志物的传感检测新技术教育部生物医学工程类专业教学指导委员会“十三五”规划教材生物医学传感与检测原理第八章01免疫传感器作为免疫系统的一部分，抗体是由淋巴细胞的白细胞合成的糖蛋白，也称为免疫球蛋白。免疫球蛋白分为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中，血液中含量最丰富的是IgG。IgG的基本结构是一个“Y”字形的四肽链结构，包括两条相同的低分子量的轻链和两条相同的高分子量的重链。抗原与抗体及其固定间接竞争法间接竞争法是将抗原与蛋白质的结合物固定在载体表面，待测溶液中的抗原与固定的抗原竞争性地结合游离的过量抗体，经过清洗后，加入标记二抗与结合在载体表面的抗体结合，建立结合的标记二抗信号与待测物抗原的浓度之间的关系来实现对待测物的检测。直接竞争法直接竞争法的检测原理主要有两种。一种是将抗原固定在载体表面，待测溶液中的抗原与固定的抗原竞争性地结合标记的抗体，经过清洗后，检测结合的标记抗体信号的变化来实现对待测物的检测。抗原与抗体及其固定夹心法夹心法是将抗体固定在载体上，加入含抗原待测物与抗体反应，经过清洗后，形成的免疫复合物再与过量的标记二抗反应，二抗只与相应的抗原发生特异性结合，形成“一抗抗原二抗”的夹心结构，检测标记物产生的信号来实现对待测物的检测。直接结合法直接结合法免疫分析法是将抗体或抗原固定在载体表面，待测的抗原或抗体被捕获后引起响应信号的变化，从而实现对待测物的检测。抗原与抗体及其固定SPR免疫传感器SPR传感器在金属-液体界面靠液体一侧的典型探测深度约为200nm，这一特点使SPR成为一种表面敏感的检测技术，是检测表面固定的生物分子与液相中待测物分子相互作用的理想方法。光纤与光波导免疫传感器尽管光纤生物传感器可基于不同的检测原理，它们基本还是采用激光作为光源。大多数利用激光作为光源的大型传感检测设备都可以利用光纤进行小型化，如荧光和光吸收检测。光学免疫传感器压电晶体免疫传感器压电传感器的基本原理是某些电解质材料受力后可产生压电效应及基于压电效应的质量频率关系，压电晶体免疫传感器是利用压电晶体对质量变化的敏感性及抗原抗体结合的特异性而建立的一种新型生物传感检测系统，又称为石英晶体微天平（QCM），可用于多种抗原或抗体的快速、定量检测及反应动力学研究。02生物芯片与生物分子检测基因传感器基因传感器（又称DNA传感器），是利用DNA双链的碱基互补配对原则发展起来的生物传感技术，它以DNA分子作为敏感元件，通过固定在感受器表面上的已知核苷酸序列的单链DNA分子（也称ssDNA探针），使其与另一条互补的ssDNA分子（也称目标DNA）杂交，形成双链DNA（dsDNA）；换能器在杂交过程中将杂交产物所产生的变化转换成电、光、声等物理信号，在检测、解析这些信号过程中得出相关基因信息。生物分子传感技术分子印迹生物传感器分子印迹生物传感器是利用分子印迹技术制备而成的生物敏感膜传感器。分子印迹（MIP）是利用对特定化合物的预订选择性制备合成的识别位点，此处的敏感膜是一种高分子聚合物。纳米生物传感器纳米尺度（1~100nm）是原子、分子为代表的微观世界和宏观物体交界的过渡区域，在该尺度下系统既非典型的微观结构亦非典型的宏观结构，因此物质会表现出独特的化学性质和物理性质，如小尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应等。生物分子传感技术生物芯片传感技术最初的生物芯片的主要目标是进行特定DNA含量的定量检测分析，目前已经拓展到了蛋白、细胞、组织等领域，统称为生物芯片。生物芯片将处理好的待测生物样本与已标记的目标分子探针反应。生物分子反应通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的扫描、检测、收集，然后经计算机分析，建立生物学模型，实现样品的检测分析。信号的检测与分析生物芯片采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子，如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品，有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子阵列。芯片的制备生物芯片基因芯片基因芯片（即DNA芯片）是将成百上千个DNA探针，借助微加工技术和微装配技术集成在一个数平方毫米或平方厘米的基底载片上形成寡聚核苷酸探针阵列。探针与靶基因核酸分子碱基互补配对，由不同荧光染料处理后的样品分子与点阵DNA分子杂交反应后形成不同颜色点阵，利用高通量成像采集分析数据，可一次获得数十万个基因的表达信息。生物芯片蛋白质芯片几乎所有的生物化学反应均发生在复杂的蛋白质分子之间或者有蛋白质参与，因此，在传统ELISA、放射免疫测定等蛋白检测方法的基础上，蛋白质芯片成为生物芯片的新成员。03仿生传感器生物的嗅觉系统能识别和分辨大量不同的气味分子，在生物感知外界化学信号的过程中发挥了极其重要的作用。嗅觉感受器是位于嗅黏膜上皮的嗅神经元，气体分子进入鼻腔后到达嗅黏膜上皮，上面分布了很多含有嗅觉受体蛋白的嗅神经元的纤毛。味觉主要分为酸、甜、苦、咸和鲜五种基本味觉。食物的各种味道是由这五种基本味觉组合而成的。嗅觉与味觉的生物学原理必须满足以下几点要求：①有一定的交互敏感能力，能同时对待测物中几种不同组分有一定的响应；②有一定的选择性，对不同的组分具有不同的响应能力；③各项参数以及响应信号必须稳定，具有重现性；④在不同的检测环境下需要有较长使用寿命。仿生化学传感器技术一种利用味觉感受细胞和味觉受体蛋白的仿生味觉传感器。在受体分子水平上，利用苦味受体蛋白作为敏感元件，结合石英晶体微天平（QCM）作为二级换能器，采用自组装膜的方法捕获和固定苦味受体蛋白，开发了一种可以检测特异性苦味物质的仿生味觉传感器，可成功记录到苦味物质引发的细胞响应信号，并通过主成分分析的方法可以将不同的苦味物质区分开。仿生化学传感器技术仿生化学传感器技术基于光寻址电位传感器独特的单细胞检测性能，以嗅神经元作为敏感元件，开发出可以用于特异性气味分子检测和嗅觉信号转导机理研究的仿生传感器，如图8-18所示。仿生传感器感觉辨识模型仿生传感器阵列系统的设计需要考虑化学及生物两方面的特性。传感原理、参数及数据处理等化学特性的研究有助于获得更合适的化学传感器，而对生物学原型的研究有利于了解感觉器官的组织和功能，从而设计出更加智能化的传感器阵列系统。最早的多个化学传感器的集成是为了模仿人类嗅觉器官以实现多种气体成分的分析。仿生传感器感觉辨识模型人类嗅觉器官相当灵敏，可识别多达数万种物质，灵敏度高达40个分子。嗅觉能力主要通过数以百万计（几百种不同类型）的受体来完成。每种受体的选择性并不高，但是受体阵列检测的信号通过周围和中枢神经系统处理后便可以获得很好的识别效果。味觉系统与嗅觉系统的工作情况类似，只是受体数目更少一些。与只检测某种特定化学物质的传统化学传感器不同，人类感觉器官并不是区分每一种化学物质，而是感知化学物质在感受器上的整体表现。仿生传感器感觉辨识模型生物传感系统卓越的能力促使研究者考虑用相同的组织原理来设计仿生感觉系统。其中，传感器阵列相当于鼻子和舌头中的感受器，感受不同的化学物质。传感器采集信号并把信息输入计算机，计算机代替生物系统中的大脑功能，通过软件进行分析处理，区分辨识不同的物质，最后给出感官信息。电子鼻传感检测装置电子鼻的思想源于人类嗅觉机制，包括“气味”传感器阵列、数据处理器、模式识别系统。传感器阵列模拟人类嗅觉受体细胞，用作信号接收器。自从化学传感器阵列被用于嗅觉分析后，科学家通过努力研制了基于不同传感检测原理的阵列系统。仿生味觉嗅觉系统仿生味觉嗅觉系统图8-20是美国加州理工大学JPL实验室设计开发的一种具有36个传感器的电子鼻样机。仿生味觉嗅觉系统一种可用于肺癌早期诊断的呼吸检测电子鼻系统如图8-21所示。仿生电子舌传感检测装置电子舌系统可由任意可用于液体分析的化学传感器组成，不受其物理操作原理的限制。最早的多传感器电子舌系统由日本科学家Hayashi等人在20世纪90年代开发，它由8个电位器式传感器构成，主要传感界面是PVC基质上的液态脂膜，对不同味觉物质有交叉敏感性。仿生味觉嗅觉系统04微流控芯片系统在生物医学传感与检测中的应用微流控技术发展微全分析系统（MicroTotalAnalysisSystems，μTAS）是20世纪90年代提出并发展起来的一个全新的跨学科研究领域。它基于分析化学、微机电系统（Micro-electro-mechanicalSystem，MEMS）、计算机、电子学、材料科学、生物学和医学等多个