慢性应激对大鼠肠道微生态的影响及松花粉的保健食品作用

慢性应激对大鼠肠道微生态的影响及松花粉的保健食品作用

在该实验室，我们观察并研究了在模拟重力损失条件下改变大鼠肠道菌群的变化，结果表明，在模拟重力损失条件下，大鼠肠道菌群失调，这意味着从肠道中受益的厌氧菌双螺线菌的数量减少，必要氧的细菌——肠球菌的数量增加。在大鼠饲料中添加低聚糖水苏糖可以改善模拟损失大鼠肠菌群的失调。然而,失重只是航天环境因素中的一个方面,噪声、狭小空间(束缚)、恐惧(束缚)和疲劳(体力上和心理上的)等因素也不可避免地会作用于航天员的身体,使航天员处于一种应激状态,导致神经内分泌的变化,从而造成全身各器官和系统的改变。这种变化应该也会对航天员肠道微生态平衡产生负面影响。俄罗斯(前苏联)研究人员发现,航天期间所有航天员都发生不同程度的肠道菌群失调,这种失调的特点为以厌氧菌为代表的“屏障”微生物种群数量降低,直至完全消失,在原籍菌的生境中出现过路菌及条件致病菌,这种变化即所谓的肠道微生态紊乱,能够对航天员的健康构成潜在威胁。研究表明,机体胃肠道微生态的平衡与稳定受多种体内外因素的影响。航天特殊环境因素以及神经和情绪紧张,在航天员自身微菌群生态紊乱的形成与发展中具有重要作用。理论和实践都证实,保持机体肠道微生态平衡对维护航天员的健康和佳态是十分必要的。目前尚未见国内关于在慢性应激条件下机体肠道微生态变化方面的报道。本研究拟利用复合因素大鼠慢性应激模型,观察大鼠以肠道微菌群改变为主的生理生化变化情况,探讨慢性应激条件对机体肠道微生态的影响及可能的机理。通过给大鼠饲料中添加松花粉类保健食品材料,观察其对慢性应激条件下机体的保健作用。为从膳食营养途径防护和改善慢性应激因素所致航天员的亚健康状态提供实验依据。实验动物的确定与模型的建立实验动物及材料基础饲料:SPF级大、小鼠生长维持粉末饲料,北京科澳协力饲料有限公司生产。松花粉:中国林业科学院松花粉研究开发中心当年产松花粉。水苏糖:西安德施普生物制品有限责任公司生产。大鼠:SPF级清洁SD雄性大鼠,体重(120±10)g,由北京动物实验中心提供。实验分组及应激动物模型的建立动物购回后适应性喂养3d后进行分组。根据动物体重将动物随机平均分为4组,每组10只:正常对照组(normalcontrol,NC),饲喂大鼠基础饲料;慢性应激对照组(chronicstresscontrol,SC),饲喂大鼠基础饲料;慢性应激松花粉组(chronicstresspinepollen,PP),饲喂在基础饲料中添加了5%亚林松花粉的饲料;慢性应激水苏糖组(stachyose,ST),饲喂在大鼠基础饲料中添加了1%水苏糖的饲料。所有大鼠均饮用纯净水,实验期间大鼠自由进食和饮水。慢性应激动物模型采用3种刺激因素建立慢性应激动物模型:1)头低位束缚:束缚造模采用自己研制的束缚筒。该筒由两部分组成,前部为铁皮制作的圆椎管形铁筒,长5cm,大口内径6cm,小口内径2cm,大口与一长25cm的布质袖套连接,袖套开口直径8~10cm,为大鼠的进入口。大鼠置入后,驱使其头部进入铁皮椎管内,然后紧贴鼠身体束紧布套,在尾部用别针别住,使其无活动空间。大鼠固定后,将其头低位放置在坡度为15~20°的斜面上,时间为6h。2)强迫游泳:大鼠在水深50cm、直径80cm的水箱中游泳,水温控制在25±2℃左右,将大鼠尾部系1/5体重的负荷,记录游泳开始到衰竭(鼻子没入水中8s为止)的时间。另外,大鼠进食量的多少会影响称重和游泳时间,在试验前禁食12h。3)噪声刺激:噪声条件为1500Hz,92dB,每次1h,在本所噪声实验室中进行。动物分组后进食相应的饲料,1周后开始正式实验(目的是观察各组大鼠的初始状态是否有所不同)。每天随机选一种应激方式作用于应激组的动物,实验期46d。具体过程为:第1、6、9、10、13、18、20、21、22、24、27、31、32、35、38、40、43、45天噪声应激;第2、5、8、12、15、17、23、26、30、33、36、39、41、44天强迫游泳;第3、4、7、11、14、16、19、25、28、29、34、37、42、46天束缚应激。对照组在不受实验应激原的影响下,同期饲养46d。大鼠每次进行游泳实验时称一次体重,观察其一般生长情况。大鼠肠道菌群分析粪便标本采集分别在正式实验开始前1d(第0天),实验开始后第7、21、28、32、35和42天,采取逼迫法取大鼠新鲜粪便,第47天处死大鼠后取盲肠内容物,进行粪便菌群分析。粪便细菌培养按照熊德鑫厌氧菌分离鉴定方法制备选择性需氧培养基(EMB、EC)以及厌氧培养基(KV、TPY、MRS)。采样取大鼠新鲜粪便0.1g左右,立即装入已称重并装有4ml生理盐水和2~3粒玻璃珠的无菌试管中,装样后的试管再次称重,求得样本重量,盖好管塞后放在液体快速振荡器上混合,制成均匀悬液,然后用生理盐水以10倍的比例倍比稀释成系列。取上述处理的样本系列稀释液0.01ml接种到5种选择性培养基上,分别置于厌氧和需氧环境中培养。需氧培养37℃24h观察结果,厌氧培养48h后观察结果,记录菌落数。计算公式:每克粪便中的活菌集落数对数值CFU/g=log{[标本重量(g)+稀释液量(ml)]/标本重量×稀释度×菌落个数×100}生化指标的测定实验结束日采用断头法处死大鼠,收集血液,室温下凝固20min,低温离心分离血清(4℃、4000r/min),进行血生化指标和免疫指标的测定。采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定大鼠血清中的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)和促肾上腺皮质激素(ACTH)。统计分析所有实验数据均以ˉx±s表示,采用SPSS11.0统计软件进行方差分析并作t-检验。慢性应激实验期间大鼠粪被调节性指标慢性应激对大鼠体重增长的影响在实验期间,对大鼠体重增长情况进行了观察,观察结果见表1。从表1可以看出,在慢性应激实验期间,从第1周起,ST和PP组大鼠的体重增长速度明显减慢,从第3周起,SC组大鼠的体重增长速度也开始明显减慢。慢性应激对大鼠肠道菌群的影响在实验期间,每隔5~7d进行一次大鼠粪便菌群分析,检测结果见表1~5。实验初始检测结果各组无差别,资料未给出。从表2可以看出,在慢性应激实验期间,SC组大鼠与其他各组大鼠相比,粪便双歧杆菌的数量总体呈下降趋势,而PP组大鼠则不明显。从表3可以看出,在慢性应激实验期间,SC组大鼠与其他各组大鼠相比,粪便乳杆菌的数量除在第1周降低外,其他时间各组大鼠均无明显差异。从表4可以看出,在慢性应激实验期间,SC组大鼠与NC组和PP组大鼠相比,除第1周和第7周两次检测结果粪便类杆菌的数量明显下降。其它时间各组大鼠间的差异均不明显。从表5可以看出,在慢性应激实验期间的大多数时间,SC组大鼠与其他各组大鼠相比,粪便肠球菌的数量明显升高。从表6可以看出,在慢性应激实验期间,SC组大鼠与PP粉组和ST组大鼠相比,从第4周起,粪便肠杆菌的数量总体呈增加趋势。各组大鼠粪便过路菌群与原籍菌群数量的比值各组大鼠不同时间内过路菌群(肠杆菌与肠球菌)与原籍菌群(双歧杆菌、乳杆菌与类杆菌)数量的比值见表7。从表7可以看出,在慢性应激实验期间的大多数时间,SC组大鼠粪便过路菌群与原籍菌群数量的比值均高于其他各组大鼠。提示在慢性应激条件下,SC组大鼠发生了过路菌群中肠杆菌和肠球菌数量增加、原籍菌群中双歧杆菌减少为特征的肠道微生态紊乱的现象。慢性应激大鼠神经内分泌激素的变化为了了解大鼠慢性应激期间神经内分泌系统变化情况,实验结束日对大鼠血清促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)和促肾上腺皮质激素(ACTH)进行了测定,测定结果见表8。从表8结果可以发现,血清CRH水平慢性应激实验3组大鼠都有升高,但PP和ST组与NC组之间差异无显著性,而SC组大鼠明显高于其它3组大鼠。这表明在实验应激因素的作用下,实验大鼠神经内分泌系统处于应激状态。但从血清ACTH水平来看,实验组3组大鼠均明显低于NC组大鼠,显示在慢性应激期间,实验组大鼠神经内分泌系统功能衰竭。从反应程度来看,以SC组大鼠最差。松花粉对慢性应激肠道微生态失调的作用大肠菌群是人体内种类最多、数量最大的细菌库,尤其是以双歧杆菌为代表的肠道益生菌的数量和比例对人体具有十分重要的生理意义。在某种程度上可以说,人体肠道微菌群的种类、数量和比例及相互作用情况即肠道微生态状况,与人体的健康息息相关。本实验采用多种刺激因素长时间反复作用于大鼠,使大鼠处于慢性应激状态。实验结果表明在慢性应激条件下,大鼠肠道菌群发生明显的变化:实验对照组大鼠肠道菌群中肠球菌数量显著增加,肠杆菌的数量也有增加的趋势;双歧杆菌的数量显著减少;而乳杆菌数量变化不太明显,在所有检测的菌种中以双歧杆菌变化最显著。慢性应激组过路菌群的数量与原籍菌的数量的比值也比对照组高,说明在慢性应激条件下出现了过路菌的增加和/或原籍菌的减少现象。综上,在慢性应激条件下,大鼠肠道菌群之间的平衡被破坏,即出现了肠道微生态失调,发生了不利于健康的变化。松花粉组大鼠在整个实验期间双歧杆菌数量无明显减少,表明食用松花粉能够有效地防护慢性应激导致的肠道微生态失调,且其作用优于功能单一的低聚糖。在慢性应激条件下,导致大鼠肠道菌群失调的确切原因尚不清楚,推测与慢性应激条件下消化道功能紊乱由关。在头低位束缚条件下,身体固定和体液向头部和上体转移可造成消化道运动减少,消化液分泌活动发生改变,这些变化对肠道微生态均有直接影响。已知肠蠕动在控制细菌生长中起重要作用,束缚时肠蠕动减弱,结肠通过时间延长,可造成肠内腐败菌的过度增殖,消化液分泌的数量和性质决定食糜的组成,也决定了肠道内容物的性状,从而影响肠道微生物的构成。且应激本身也可造成消化液分泌、肠道蠕动和血流量及黏膜的改变,引起消化道功能紊乱,对肠道益生菌产生不利的影响,从而导致了肠道微生态的失调。同时,噪声刺激和强迫游泳的过程对大鼠也是较大的刺激,大鼠必定对该刺激产生较大的应激反应,并导致神经内分泌的变化,进而引发一系列全身器官和系统的改变。按塞里学说,当刺激因素长期存在时,机体神经内分泌系统的功能进入衰竭期,表现为CRH升高,ACTH下降,陈易新慢性束缚实验大鼠观察到此现象,从本实验大鼠血清CRH和ACTH的水平似乎也能够得到证实。机体应激反应低下时,其中包括消化系统功能紊乱。松花粉防护慢性应激肠道微生态紊乱的确切机理仍不清楚。松花粉是我国特有乡土树种-马尾松和油松的花粉,它是松树花蕊的精细胞。它含有种类齐全、最佳搭配的营养成分,多达200余种,凡维生素、氨基酸、酶、脂类、碳水化物和矿物质都含有,且每种成份含量均很丰富,全部属于活性,能在很短的时间内不必经消化直接被人体吸收。食用松花粉能够均衡地补充营养和大量的生命元素,调节人体内分泌系统和消化功能,有效地增强体质、调整机体状态,强化机体新陈代谢。推测松花粉的防护作用可能与其