菜蛾盘绒茧蜂coesiaplulelae定位及其对寄主小菜蛾幼虫的影响

菜蛾盘绒茧蜂coesiaplulelae定位及其对寄主小菜蛾幼虫的影响

通常，dna病毒（pdv）是膜门腔蚕科和ichneumonidae存在的一种特殊病毒。它的血浆由10.28个分歧点的双链环状dna分子组成，片段从2km到25km不等（stolztal.，1984；freim和krell，1993；webb，1998）。整个重组规模约为75250kg（cui和webb，1996，1997；webb和cui，1998）。PDV在雌蜂输卵管萼细胞内复制,并从蛹期开始直至整个成虫期持续进行(BuronandBeckage,1992;Beckage,1998)。雌蜂产卵时,随蜂卵将萼液(主要含PDV)一同注入寄主血腔。PDV的基因开始表达,发挥免疫抑制功能(Strand,1994;Harwoodetal.,1994;StrandandPech,1995a;Strandetal.,1997;ShelbyandWebb,1999);调节寄主内分泌系统,如降低寄主幼虫体内蜕皮甾酮的滴度,抑制保幼激素酯酶活性,提高保幼激素滴度,延长末龄幼虫期,使之不能化蛹(Doveretal.,1987;SollerandLanzrein,1996;Cussonetal.,2000),调控寄主的发育使之朝着有利于寄生蜂发育的方向发展。有关PDV的结构特性和功能已在一些寄生蜂-寄主系统中进行了研究(Edsonetal.,1981;Stoltzetal.,1988;BuronandBeckage,1992;ShelbyandWebb,1997),但在不同的体系中作用方式不同,具有种的特异性,如基因在寄主中的表达部位、发挥作用的途径、基因产物的表达时间、调控寄主内分泌系统的作用方式等(Strandetal.,1992;DushayandBeckage,1993;Beckageetal.,1994;DoucetandCusson,1996;GuptaandFerkovich,1998;HochandSchopf,2001)。我们选取菜蛾盘绒茧蜂CotesiaplutellaeKurdj.(膜翅目:茧蜂科)和小菜蛾PlutellaxylostellaL.(鳞翅目:菜蛾科)作为研究体系,不仅因为小菜蛾是世界性蔬菜害虫,抗药性突出,目前尚缺乏有效的防治措施,而菜蛾盘绒茧蜂是其主要的优势寄生性天敌;而且因为该蜂拥有目前国际上研究所揭示的几乎所有的寄生蜂因子(另文发表),是一个经过长期自然选择而适应寄生小菜蛾的种类。菜蛾盘绒茧蜂-小菜蛾系统可作为一个很好的研究寄生蜂-寄主协同进化的模式系统。我们首次研究该体系的PDV,可望通过PDV对寄主生理效应的研究,使天敌的控害潜能得以更有效的发挥,为提高小菜蛾生物防治水平提供理论依据。1材料和方法1.1semclausumhelen膜翅目,姬蜂科小菜蛾幼虫饲喂嫩甘蓝叶片;菜蛾盘绒茧蜂采自杭州郊区菜田;半闭弯尾姬蜂DiadegmasemiclausumHellén(膜翅目:姬蜂科)由澳大利亚昆士兰大学提供。以2龄末小菜蛾幼虫为寄主,待蜂结茧后,观察记录羽化时间,并将同批羽化的成蜂收集在放有10%蜂蜜水棉球的蜂盒内,在24±1℃,60%～80%RH,光照周期14L∶10D的条件下饲养。1.2寄生虫时间的测定将交配过的菜蛾盘绒茧蜂1头移入指形管(8cm×15cm)内,分别接入2龄末、3龄、4龄初及4龄末小菜蛾幼虫1头,一次寄生行为发生后,换以未接触过蜂的同龄小菜蛾幼虫,控制每蜂寄生5～8头;寄生头数达到实验所需,记录寄生时间;将寄生后的小菜蛾幼虫接入插有嫩甘蓝叶片的塑料养虫笼内,供试昆虫在上述条件下饲养。1.3寄生虫情况观察用剂量分别为50、100、150、200Gy的Co60照射交配过的雌蜂,随后按上述方法让其寄生2龄、3龄和4龄初小菜蛾幼虫;对即将化蛹的4龄末幼虫,进行过寄生,即一头寄主被连续寄生9次;每日解剖20头被寄生寄主,观察各处理寄生蜂卵孵化情况并统计蜂卵的包囊率;以未经辐射处理的正常雌蜂寄生的同龄小菜蛾幼虫作比较,观察假寄生(蜂卵不孵化的情况)对寄主小菜蛾幼虫发育的影响,同时以未寄生的同龄小菜蛾幼虫作对照。1.4透射电镜观察解剖镜下,在Ringer生理盐水中拉出茧蜂整个生殖系统(LeicaMPS30拍照)及两种雌蜂卵巢,用尖嘴镊撕破输卵管萼,吸取少量萼液(calyxfluid)滴在覆有Formvar膜的铜网上,再滴加少量2%磷钨酸,自然风干后,JEM-1200EX透射电镜观察。将整个茧蜂的卵巢及被寄生0.5h和1.5h后的小菜蛾幼虫,放入2.5%的戊二醛中,4℃下前固定4h以上,0.1mol/L的PBS冲洗,1%的锇酸后固定2h,乙醇梯度脱水,Epon812包埋,选取输卵管萼等卵巢不同部位及被寄生的小菜蛾腹部中间有蜂卵的部位进行超薄切片,醋酸铀和柠檬酸铅染色,JEM-1200EX透射电镜观察。2结果2.1膜透射电镜观察菜蛾盘绒茧蜂雌蜂有一对毒腺和1个毒囊,并有一对卵巢(图版Ⅰ:1)。它与半闭弯尾姬蜂雌蜂卵巢都有发达的萼区,萼区内充满淡蓝色萼液,从中可观察到大量的PDV。透射电镜观察显示,两种蜂的PDV形态有很大差异(表1)。其中最明显的特征是茧蜂PDV含有多个核衣壳,棒形,外被单层膜(图版Ⅰ:2,3);而姬蜂PDV只含有一个核衣壳,梭形,双层膜包被(图版Ⅰ:4)。它们分别属于多分DNA病毒科(Polydnaviridae)的茧蜂病毒属Bracovirus和姬蜂病毒属Ichnovirus。2.2张量病毒短板壳内pdv的复制过程菜蛾盘绒茧蜂卵巢中未成熟卵外有一层滤泡细胞,有类微绒毛的突起物覆盖在卵表面(图版Ⅱ:1);成熟卵表面有致密的病毒样纤丝(virus-likefilament,VLF)覆盖(图版Ⅱ:2);在萼区,卵周围有大量的PDV,但两者之间有明显的空隙(图版Ⅱ:3,4),在卵内未发现有PDV的存在。组成萼壁外层的上皮细胞不进行PDV复制(图版Ⅱ:6)。在输卵管腔与萼细胞之间有隔壁桥粒(septatedesmosome)将它们连接(图版Ⅱ:7),并有表皮层将输卵管腔与萼区外层上皮细胞分隔(图版Ⅱ:5)。PDV的核酸复制和随后的装配均在细胞核内进行,PDV在富含病毒发生基质(virogenicstroma)的萼细胞核的外层进行核酸的复制并在核心部分装配,核衣壳在包膜前,有时呈棒状排列(图版Ⅱ:8～12);随着PDV的大量复制,萼细胞的细胞核变大,而细胞质变小。每个PDV最多拥有16个核衣壳,直径39～40nm。萼细胞在完成PDV复制后解体,将PDV释放到输卵管腔。2.3cdv的表观雌蜂产卵时,将PDV等寄生蜂因子也一同注入到寄主体内,在蜂卵的表面可看到PDV,并首先在寄主血淋巴中运行,接着运行到寄主的许多组织(图版Ⅲ:1,2);PDV可能先通过PDV的脱病毒囊膜成为单个的核衣壳,再进行对寄主组织的侵染(图版Ⅲ:3)。2.4幼虫期的发育不同辐射剂量处理后的雌蜂都能正常产卵寄生,对被寄生寄主的整个发育期进行连续解剖发现,所有蜂卵均不能孵化,但有轻微的发育。而且绝大多数蜂卵均未被寄主血细胞包囊。寄生后7天内,与之对照的未寄生寄主则结茧化蛹;正常寄生的2龄、3龄和4龄初寄主体内的幼蜂也完成了幼虫期发育,吐丝结茧;假寄生的2龄、3龄和4龄初寄主表现为幼虫期延长至少10天,而且几乎全部不能化蛹,但幼虫胸部出现褐色的短翅芽(图版Ⅳ:1,2)。4龄末小菜蛾幼虫被假寄生后,即使被过寄生9次,依然能正常化蛹,并有成虫触角、褐色翅等特征的出现,但不能羽化(图版Ⅳ:3)。与此同时,4龄末被正常寄生的小菜蛾幼虫,部分能够正常化蛹,但多数在幼虫期死亡,蛹体或幼虫体内的幼蜂、畸形细胞的发育均迟于同批寄生低龄寄主体内的幼蜂和畸形细胞的发育(图版Ⅳ:4)。假寄生后,寄主脂肪体结构完整、致密,数量多(图版Ⅳ:5);正常寄生后,寄主脂肪体结构松散,数量少(图版Ⅳ:6);它们与未寄生小菜蛾幼虫体内的脂肪体在物质积累上有差异,如图中黄色物质的积累(图版Ⅳ:7)。3不同药物对克氏原螯虾幼蜂系统的调节寄生蜂雌蜂注入到寄主中的PDV,首先侵染寄主的血细胞,使细胞失去延展和附着能力,抑制寄主血细胞对寄生蜂卵的包囊能力(Strandetal.,1992;StrandandPech,1995b;Strandetal.,1997)。本实验通过连续解剖发现,假寄生2龄、3龄和4龄初小菜蛾幼虫体内的蜂卵无一被寄主血细胞包囊,说明菜蛾盘绒茧蜂PDV和毒液具有免疫抑制功能。PDV还能侵染寄主的其它组织,如肌肉层、气管上皮细胞、脂肪体细胞等,大量的PDV似乎在基膜处通过脱膜而穿透到组织中,裸露的核衣壳在核膜孔呈垂直排列,随后将核酸成分倾入寄主细胞核,在外只剩空的衣壳(BuronandBeckage,1992)。我们的观察显示PDV在侵染寄主组织前也先脱去病毒囊膜而成为单个的核衣壳。雌蜂经辐射处理后,虽能正常产卵寄生,但所产卵不能孵化,这样造成假寄生,可以在排除寄生蜂卵孵化时释放的畸形细胞、随后的幼蜂及其前二者来源蛋白的情况下,单独分析寄生蜂在产卵时注入的PDV、毒液等寄生蜂因子的作用。结果表明:被假寄生的2龄、3龄和4龄初小菜蛾幼虫几乎全部不能化蛹,说明PDV和毒液不仅能克服寄主血细胞对蜂卵的免疫包囊反应,而且能调节寄主的内分泌系统,如抑制寄主末龄幼虫与变态有关的蜕皮酮峰的出现,使寄主不能正常蜕皮化蛹,而保持幼虫状态。但在假寄生后期,可能由于寄主小菜蛾的代谢作用,或因PDV、毒液的时间效应,PDV基因产物表达量下降,引起了寄主在幼虫期的翅芽发育,有关产生这一特殊现象的分子作用机理还有待做进一步研究,但最终寄主均在幼虫期死亡;4龄末小菜蛾幼虫被假寄生后,表现为能够正常化蛹,并有成虫特征的出现;与之相应,在4龄末被正常寄生的寄主也有部分虫体化蛹,说明寄主发育到一定时期,如某一“阈值”,可能由于寄主化蛹前末龄幼虫期蜕皮激素的释放(Deanetal.,1980),PDV、毒液、畸形细胞等寄生蜂因子在调节寄主内分泌系统包括保幼激素和蜕皮激素滴度变化上失去作用,造成了寄主的化蛹。但与假寄生相比,4龄末小菜蛾幼虫被正常寄生后,仍有多数寄主为幼虫状,则表明在一定程度上,畸形细胞或幼蜂在调节寄主内分泌系统中发挥了作用。已有研究证实,单独注射红足侧沟茧蜂Microplitiscroceipes的畸形细胞,能抑制寄主烟芽夜蛾Heliothisvirescens保幼激素酯酶的活性而间接影响蜕皮激素滴度,从而延长寄主末龄幼虫期(ZhangandDahlman,1992)。通过多次假寄生(即过寄生),从而加大PDV和毒液生理剂量的手段,观察了4龄末寄主被假寄生后的发育情况。结果表明,寄主仍能正常化蛹,从而推翻了过去认为的一种观点:高龄寄主虫体大,寄生蜂产卵注入的寄生蜂因子相对生理剂量低而导致寄主化蛹。这与假寄生2龄、3龄和4龄初寄主幼虫显著延长寄主末龄幼虫期的情况不同,说明PDV和毒液对寄主幼虫发育的调控受寄主发育龄期生理状态的影响;但即使能化蛹也不能羽化的现象则表明PDV和毒液对寄主蛹期的发育也有生理效应。昆虫体内蕴藏着大量的脂肪体,是昆虫生命代谢的中心组织,它强烈地影响体内各个组织器官的生理功能。因此对寄主脂肪体的研究可从本质上揭示寄生蜂对寄主的生理调节机制。本研究初步表明:假寄生和正常寄生引起寄主脂肪体的数量和形态与正常发育的小菜蛾体内的脂肪体有差异。我们进一步的研究结果也已证实小菜蛾幼虫在三种状态下,脂肪体细胞的显微、超微形态结构及脂滴和蛋白质组成都存在很大差异(