乳腺癌原发癌与淋巴结转移癌基因表达差异比较

乳腺癌原发癌与淋巴结转移癌基因表达差异比较

基因芯片技术广泛应用于肿瘤相关功能基因的筛选。基因芯片传统的编码方法包括直接标记法和rna扩张法。这两种方法所需的总氮含量为5.100g，但由于临床样本量的限制，大多数方法无法满足实验要求。单引物扩增(singleprimeramplification,SPA)是一种新的靶标标记方法,灵敏性高于直接标记法和RNA扩增法。本研究采用SPA方法标记的基因芯片技术比较乳腺原发癌与淋巴结转移癌的基因表达差异,筛选乳腺癌转移相关基因。pcr扩增产物和纯化1.对象:淋巴结转移阳性乳腺癌组织样本取自2002年1月至12月天津医科大学附属肿瘤医院乳腺科收治的行乳腺根治术的乳腺癌患者。每个病例分别取原发癌和腋窝淋巴结转移癌组织,经病理组织学证实淋巴结转移癌中癌细胞达75%以上。用于基因芯片杂交的10例乳腺原发癌的病理类型包括单纯癌7例,髓样癌2例,浸润性导管癌1例;用于实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证的30例乳腺癌,包括单纯癌19例,髓样癌6例,浸润性导管癌5例。2.基因芯片筛选乳腺原发癌与淋巴结转移癌的差异表达基因:(1)总RNA提取:采用Trizol(美国Invitrogen公司)提取组织细胞总RNA,RNeasymidi试剂盒(德国Qiagen公司)纯化RNA,GeneQuantproRNA/DNACalculator(英国PharmaciaBiotech)定量RNA浓度,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。(2)双链cDNA(dscDNA)合成:采用cDNA合成试剂盒(M-MLVversion)(中国TakaRa公司),操作按试剂说明。20μl反应体系,取总RNA2.0μg,Heel-Oligo(dT)17的序列为CTCTCAAGGATCTTACCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTV。dscDNA产物用QIAquickPCR纯化试剂盒(德国Qiagen公司)纯化后溶于60μlelutionbuffer中。(3)SPA:100μl反应体系中,含15μldscDNA(起始于0.5μg总RNA),2μmol/LHeelPrimer(序列为CTCTCAAGGATCTTACCGC),0.2mmol/LdNTP,12.5UTaq酶。反应条件为:94℃1min,56℃1min,72℃2min,40个循环。扩增产物用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化。(4)荧光标记:采用随机引物标记试剂盒(中国TakaRa公司),操作按试剂说明,Cy3-dCTP和Cy5-dCTP(英国AmershamPhamaciaBiotech公司)分别标记原发癌和淋巴结转移癌样本。50μl反应体系中,含4μgSPA产物(起始于0.25μg总RNA),0.12mmol/LdATP、dGTP、dTTP,0.06mmol/LdCTP,0.06mmol/LCy3-dCTP或Cy5-dCTP,8UKlenow片断,37℃反应1.5h。标记产物用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化。测A260、A280、A550、A650,并计算荧光掺入量。(5)基因芯片杂交:人表达谱基因芯片为北京博奥生物芯片有限公司提供的人Oligo芯片。芯片上所有基因取自Qiagen公司的人类基因70merOligo库,点样在一张75mm×25mm、经过化学修饰的载玻片上,含约23232个基因点,21329个人功能基因,还包括人的12个看家基因作为阳性对照,12个人工合成的与人基因没有同源性的70merOligoDNA作为阴性对照,以及拟南芥的3个基因作为外标。整个点阵分成48个亚阵,每个亚阵为22行、22列。点间距为185μm,点的直径约为140μm。基因芯片经60℃水合,250mJ紫外交联,0.5%十二烷基磺酸钠(SDS)及无水乙醇清洗后用于杂交。将原发癌与转移癌样本的标记产物合并后真空抽干,溶于16.8μl水中,与18.2μl杂交液混合。杂交体系中含2.0%SDS,5×Denhart,25%去离子甲酰胺,3×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)。95℃变性3min,冰浴冷却,短暂离心后点在基因芯片上,盖玻片覆盖,置于杂交盒中,42℃水浴杂交16h。将杂交后的基因芯片依次在50℃的含0.2%SDS的2×SSC、0.2×SSC和纯水中洗片。1500r/min离心1min甩干后进行荧光强度扫描。(6)基因芯片扫描及数据分析:杂交后的基因芯片用GeneTACLS-IVBiochipAnalyzer(美国Genomicsolution公司)扫描,经GenePixPro4.0(美国Axon公司)分析软件图像处理后进行线性归一化,筛选Cy3与Cy5荧光强度达1.5倍以上差异表达的基因。3.实时定量RT-PCR检测纤维粘连蛋白(FN)在乳腺原发癌与淋巴结转移癌中的表达:总RNA提取采用Trizol(美国Invitrogen公司)提取组织细胞总RNA,实时定量RT-PCR采用platinum®QuantitativeRT-PCRThermoscriptyTMOne-stepSystem(美国Invitrogen公司),实验方法按试剂说明。FN引物采用Oligo6.0软件设计:上游引物5′CCGCCGAATGTAGGACAAGA3′,下游引物5′TGCCAACAGGATGACAT-GAAA3′,TapMan探针5′(FAM)CAACCATCTCATGG-GCCCCATTCC3′(TAMRA)。GAPDH引物参考文献,上游引物5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′,下游引物5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′,TaqMan探针5′(FAM)CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC3′(TAMRA)。引物与探针由上海生工生物工程公司合成。反应条件:65℃5min,冰浴5min,50℃30min合成cDNA;PCR反应95℃3min,95℃0.5min,62℃1min,45个循环。CT值为设荧光强度阈值0.01时的循环数,以FN的CT值减去GAPDH的CT值得到ΔCT值,2-ΔCT即为FN相对与GAPDH的相对表达量。4.统计学分析:采用SPSS10.0软件,FN在原发癌与转移癌中mRNA表达量的比较采用配对t检验。结果1.差异表达基因筛选本组实验采用SPA方法进行样本靶标的荧光标记,用于基因芯片杂交的起始总RNA量为0.25μg。10例转移性乳腺癌患者的原发癌和淋巴结转移癌基因表达谱比较,1.5倍差异基因为500～2600个之间,平均差异基因约占5.5%。筛选出57个基因在至少5对样本中有1.5倍以上相同的差异表达趋势,其中19个基因在转移癌中上调,38个基因下调。用Gominer检索其功能,其中8个差异表达基因与细胞黏附和运动有关,14个与细胞间信号传导有关,14个与细胞生长代谢有关(表1)。与细胞黏附和运动有关的胶原(collagen)、FN、成骨细胞特异因子2(osteoblastspecificfactor,OSF2)和淋巴细胞选择素(selectin-L,SELL)在10例乳腺癌的原发癌与转移癌基因表达水平的比较见图1。2.mrna的表达量:转移癌30例乳腺原发癌与相应配对的淋巴结转移癌中FN的mRNA平均相对表达量比较,转移癌中FN的mRNA表达较原发癌下调3.6倍,配对t检验差异有统计学意义(t=-3.188,P<0.01)。原发癌与转移癌基因表达差异单引物扩增(singleprimeramplification,SPA)的靶标标记方法是2003年Lee等报道的。SPA的原理是通过cDNA第1链合成时的反转录引物Heel-Oligo(dT)17使第2链合成时将这一段寡核苷酸序列接入cDNA的3′末端,为一个互补的heelprimer提供了一个退火位点,heelprimer在Taq酶作用下完成cDNA的扩增反应。Lee等将SPA法标记与反转录直接标记和反转录后随机引物标记进行比较,结果证实SPA法筛选差异表达基因的能力与2种方法基本相当,而SPA方法将用于一张基因芯片杂交的起始总RNA用量降至32ng,且该方法稳定可靠,重复性好,在显著减少RNA用量的同时能有效地筛选出差异表达的基因;他们还用两次扩增的产物进行杂交,证明这3种标记方法所引起的微小差异是在cDNA合成过程中产生的,而不是在扩增时出现的。在肿瘤的演进过程中涉及大量基因的改变及相互联系,其中有些表达丰度较低的基因采用常规的标记方法无法检测到有效的荧光信号,SPA法则使这些丰度较低的基因等比例扩增,从而降低了筛选结果的假阴性率。本组实验采用SPA方法进行靶标标记,用于基因芯片杂交的起始总RNA量为0.25μg,检测灵敏度高于直接标记方法和cRNA扩增方法,可应用于样本量不足和荧光信号较弱的基因芯片杂交分析。淋巴道转移是癌细胞转移的的最常见途径,乳腺癌手术患者中近50%常规病理学诊断有淋巴道转移。淋巴道转移与其他转移途径一样是一个多阶段、多步骤的复杂过程。原发肿瘤中癌细胞的转移能力的异质性是由编码参与转移过程的生物分子的基因,即转移相关基因调控的。本组研究以乳腺癌的淋巴结转移癌作为原发癌的转移亚克隆,利用人表达谱基因芯片,通过比较原发癌与转移癌的基因表达差异筛选乳腺癌转移相关基因。在10例样本中筛选得到的1.5倍差异基因平均仅占总检测基因的5.5%,显示了原发癌与转移癌遗传背景的一致性;在筛选得到的57个有共同表达差异趋势的基因,涉及了细胞黏附和运动能力、细胞信号传导、细胞生长代谢等与转移相关的生物学过程。细胞的黏附和运动在肿瘤细胞的转移过程中起着关键作用。胶原是细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)中结缔组织的主要组成部分,使细胞与细胞、细胞与间质之间保持紧密连接。本组研究筛选出一组胶原在转移癌中表达下调,包括COL11A1、COL5A2、COL6A1、COL1A1和COL1A2,证实转移癌中的胶原除了胶原酶的降解机制外,肿瘤细胞自主表达胶原的量也较原发癌低,因而更具易于转移的恶性表型。FN是ECM中糖蛋白的一种,是黏附分子整合素的配体,肿瘤细胞分泌的FN与位于细胞表面的整合素结合,介导细胞之间或细胞与ECM间的相互作用,促进肿瘤细胞的黏附。肿瘤细胞分泌的FN量与其侵袭能力成正比,本课题组前期同类研究的结果证实FN在转移癌中的蛋白表达显著高于原发癌,但mRNA表达则相反。本组研究通过基因芯片方法筛选出FN在转移癌中的mRNA表达下调,实时定量RT-PCR检测FN在30例淋巴结转移癌中显著低于同一病例的原发癌,证实了前期的研究结果。FN在转移癌中的蛋白表达高于原发癌,但mRNA表达则下调,负反馈调节是mRNA与蛋白表达不一致的可能的机制之一。另外,FN是分泌性蛋白,原发癌与转移癌的微环境不同也有可能影响其DNA的转录与mRNA的翻译;FNDNA的转录与mRNA的翻译在肿瘤细胞侵袭和转移中的动态改变有待于进一步实验证实。OSF2是一种分泌性蛋白,属于免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子。Gillan的研究证实,OSF2是整合素αVβ3和αVβ5的配体,通过与整合素αVβ3和αVβ5结合介导细胞的黏附和运动,将细胞置于OSF2上与置于FN上比较细胞能形成较少的重力纤维并具有更强的运动性,因而OSF2较FN具有更强的转移促进作用。与FN相同,OSF2在转移癌中的mRNA表达显著低于原发癌,肿瘤细胞内OSF2的转录也可能存在着