第十三章+免疫学技术概论

第十三章免疫学技术概述[目的与要求]1、了解最新的免疫学诊断技术以及细胞免疫技术的种类与用途；2、掌握常用的免疫血清学技术及其实验原理、影响因素；3、掌握生物技术公司常用的免疫制备技术；

4、了解免疫学技术的应用及其发展趋向。[难点与重点]

重点：常用的免疫血清学技术及其实验原理、影响因素；生物技术公司常用的免疫制备技术。难点：常用的免疫血清学技术及其实验原理、影响因素。免疫学技术是指利用免疫反应的特异性原理，建立各种检测与分析技术以及建立这些技术的各种制备方法，包括：①用于抗原或抗体检测的体外免疫反应技术，或称免疫检测技术，这类技术一般都需要血清进行试验，故又称为免疫血清学反应或免疫血清学技术；②用于研究机体细胞免疫功能与状态的细胞免疫技术；③用于建立免疫检测方法的免疫制备技术，如抗体或抗原的纯化技术、抗体的标记技术。E-玫瑰花环实验正常人外周血中T细胞在体外能直接和绵羊红细胞(SRBC)结合形成玫瑰花样细胞团。这是因为人的T细胞膜上具有能和SRBC膜上的糖蛋白相结合的受体，称为E受体。已证实E受体是人T细胞所特有的表面标志，因此本试验可作为人外周血T细胞的鉴定和计数，同时作为人细胞免疫功能状态的一个检测指标，也是分离T细胞的常用方法之一。免疫标记技术第1节免疫血清学技术概述抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结合反应，因抗体主要来自血清，因此在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术，是建立在抗原抗体特异性反应基础上的检测技术。免疫血清学技术自19世纪建立了最早和最简单的凝集试验开始，不断发展，尤其是近20余年来，各种新方法、新技术层出不穷，应用面也日益扩大，已深入到生物学科的各个研究领域。免疫血清学技术按抗原抗体反应性质不同可分为凝聚性反应(包括凝集试验和沉淀试验)、标记抗体技术(包括荧光抗体、酶标抗体、放射性同位素标记抗体、化学发光标记抗体技术等)、有补体参与的反应(补体结合试验、免疫黏附血凝试验等)、中和反应(病毒中和试验等)等已普遍应用的技术，以及免疫复合物散射反应(激光散射免疫测定)、电免疫反应(免疫传感器技术)、免疫转印(westernb1otting)以及建立在抗原抗体反应基础上的免疫蛋白芯片技术等新技术。一、免疫血清学技术的类型凝集试验（血球凝集）凝集试验（细菌凝集）补体结合试验抗原-抗体反应模式图凝集反应沉淀反应对流免疫电泳火箭免疫电泳二、免疫血清学反应的一般特点(一)特异性与交叉性血清学反应具有高度特异性。这是血清学试验用于分析各种抗原和进行疾病诊断的基础。一般血缘越近，交叉反应的程度也越高。除相互交叉反应外，也有表现为单向交叉的，单向交叉在选择疫苗用菌(毒)株时有重要意义。天花牛痘(二)抗原与抗体结合机理

抗原和抗体的结合为弱能量的非共价键结合，其结合力决定于抗体的抗原结合位点与抗原表位之间形成的非共价键的数量、性质和距离，由此可分为高亲和力、中亲和力和低亲和力抗体。

(二)抗原与抗体结合机理

抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这一过程受物理、化学、热力学的法则所制约，结合的温度应在0～40℃，pH在4～9。如温度超过60℃或pH降到3以下时，则抗原抗体复合物又可重新解离。利用抗原抗体既能特异性地结合，又能在一定条件下重新分离这一特性，可进行免疫亲和层析，以制备免疫纯的抗原或抗体。抗原与抗体在适宜的条件下就能发生结合反应。但对于常规的血清学反应，如凝集反应、沉淀反应、补体结合反应等，只有在抗原与抗体呈适当比例时，结合反应才出现凝集、沉淀等可见反应结果，在最适比例时，反应最明显。这种因抗原过多或抗体过多而出现抑制可见反应的现象，称为带(zone)现象。

(二)抗原与抗体结合机理

为了克服带现象，在进行血清学反应时，需将抗原和抗体作适当稀释，通常是固定一种成分而稀释另一种成分。为了选择抗原和抗体的最适用量，也可同时递进稀释抗原和抗体，用综合变量法进行方阵测定。(二)抗原与抗体结合机理

(三)免疫血清学反应的影响因素影响免疫血清学反应的因素主要有电解质、温度、pH值等。1、电解质特异性的抗原和抗体具有对应的极性基(羧基、氨基等)，它们互相吸附后，其电荷和极性被中和因而失去亲水性，变为憎水系统。此时易受电解质的作用失去电荷而互相凝聚、发生凝集或沉淀反应。因此，需在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反应。故血清学反应一般用生理盐水作稀释液，标记抗体技术中，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)作稀释液。2、温度在一定温度下，将抗原抗体保温一定时间，可促使两个阶段的反应。较高的温度可以增加抗原和抗体接触的机会，从而加速反应的出现。将抗原、抗体反应通常在37℃(培养箱或水浴)，也可在室温下进行；亦可用56℃水浴反应更快。有的抗原或抗体系统在低温长时间结合反应更充分，如有的补体结合反应在冰箱低温结合效果更好。(三)免疫血清学反应的影响因素影响免疫血清学反应的因素主要有电解质、温度、pH值等。3、酸碱度血清学反应常用pH为6～8，过高或过低的pH值可使抗原抗体复合物重新离解。如pH值降至抗原或抗体的等电点时，可引起非特异性的酸凝集，造成假象，出现假阳性。(三)免疫血清学反应的影响因素影响免疫血清学反应的因素主要有电解质、温度、pH值等。第2节细胞免疫技术的种类与用途细胞免疫技术是指与细胞免疫有关的各种检测技术，包括对其免疫细胞、细胞因子的检测及功能分析。由于人们越来越认识到细胞免疫在肿瘤、胞内菌感染、病毒感染等疾病免疫中的重要性，使近几年来细胞免疫技术在医学和兽医学研究与临床中应用越来越广。

第2节细胞免疫技术的种类与用途

根据被检测的物质性质不同，可将细胞免疫技术分为淋巴细胞计数及分类技术、淋巴细胞功能测定技术和细胞因子检测技术以及体内细胞免疫试验等4大类。CIK是(cytokineinducedkiller)的缩写，最初是指在正常人体外周血中只占1～5%的cd3+cd56+的T淋巴细胞｡目前国内外制备的用于过继免疫治疗的cik细胞，实际上是体外扩增出的以cd3+cd56+､cd3+cd8+为主的异质性细胞群。该细胞群是在多种细胞因子如IL-2､IFN-γ及某些单克隆抗体(anti-cd3mcab)的刺激下，由从外周血､骨髓或脐血中分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有广泛的非MHC限制的极强的溶瘤活性｡第2节细胞免疫技术的种类与用途

根据被检测的物质性质不同，可将细胞免疫技术分为淋巴细胞计数及分类技术、淋巴细胞功能测定技术和细胞因子检测技术以及体内细胞免疫试验等4大类。生物治疗技术是一种“自身免疫细胞疗法”，它用“人体自身的免疫细胞杀死自己体内的肿瘤细胞”的原理来治疗肿瘤，是最具优势、最有前景的肿瘤治疗技术之一。通过提取患者自身外周血中的单个核细胞，在GMP超洁净实验室中进行诱导，激活和数量扩增成树突状细胞（DC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK），然后再回输给病人。这两种细胞对肿瘤细胞有特异性识别作用，能够广泛识别各种肿瘤细胞。当DC与CIK细胞联合作用将残留恶性肿瘤细胞完全杀灭或降低并稳定在一定水平时，即可达到肿瘤的临床治疗或控制肿瘤的复发和转移。该技术有效修复、增强了人体的免疫系统，减少了肿瘤细胞转移的几率，无痛苦，无副作用，对于手术结束后或放疗缓解期患者尤为适合。对于部分乙肝患者也可采用该方法治疗

生物免疫治疗大致分为五个主要步骤，首先是前期检查，第二是采集外周血中的单个核细胞，第三步就是细胞在实验室的激活、诱导与质控，第四步是回输CIK细胞的特点1、增殖能力强，主要效用细胞CD3+CD56+可增殖1000倍；2、杀伤活力强，远优于传统的LAK细胞和细胞因子γ干扰素、白细胞介素2等；3、杀瘤谱广，不受MHC限制，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用，对多重耐药肿瘤细胞仍敏感，杀瘤活性不受环孢素A（CsA）和FK506等免疫抑制剂的影响，能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡。4、毒副作用小，无严重不良反应。不过长度超过30bp的dsRNA会由于干扰素α应答引发非特异性基因抑制。CIK细胞治疗技术的优势1、可有清除手术、放化疗后残余的癌细胞及微小病灶，预防肿瘤的复发和转移；2、可与放、化疗联合使用，能降低放化疗的毒副作用的感染率，提高放化疗的疗效；3、可用于放、化疗无效的患者，或对化疗药物产生耐药性的患者的治疗；CIK细胞治疗技术的优势4、对于失去手术机会或已复发转移