改良高压修复法对免疫组化检测er、ki-67核抗原表达的影响

改良高压修复法对免疫组化检测er、ki-67核抗原表达的影响

在制备蜡块时，由于使用甲醛而形成的羧甲基和羟基甲基联盟蛋白质的封闭反应和热量，一些核电站的异质结链发生了扭曲，并且在免疫组化染色过程中无法显示。为了解决上述问题，需要进行抗逆剂修复。免疫组化的抗原修复有多种方法,如真空负压、微波辐射、传统煮沸、高温高压、恒温水浴、酶消化等。以高温高压、微波、酶消化等方法较为常用。其中高温高压热修复法是最常用的方法,常用的高温高压热修复方法是比较适用于大多数抗体的传统方法,但仍存在一些缺陷。主要表现在以下两方面:一方面是由于部分组织在外检取材固定和前期组织处理中很难达到标准化,导致组织过度固定或固定不良,一些抗原用传统修复法无法达到满意的修复效果,尤其以核抗原为主。另一方面,随着免疫组化指标的增多,一种修复液修复已不能满足工作需要,而使用多种修复液修复工作效率低。近2年来,我们尝试把传统法进行改良,采用改良高压锅修复法取得了较好效果,现报告如下。1材料和方法1.1er、ki-97检测本科室近2年已确诊为乳腺浸润性导管癌的组织蜡块80例,各切片4张,2张做ER(雌激素受体)检测,另2张做Ki-67(细胞增殖活性抗原)检测,每种抗原分A、B两组,各1级切片,使用不同的修复方法。A组做高压锅传统修复,B组做高压锅改良修复。1.2enviity检测鼠抗人ER单克隆抗体,鼠抗人Ki-67单克隆抗体,快捷免疫组化Envision检测试剂盒(即用型)(以上试剂均购于D0KO公司)。EDTA修复液(pH9.0)。仪器:电磁炉1800W,不锈钢高压锅,立式塑料染色缸。1.3切片的制备和免疫组化除抗原修复步骤采取不同方法外,其他步骤在时间和方法上两组都保持一致。(1)前期处理:组织切片经常规脱蜡后逐级酒精洗涤再入水冲洗,3%过氧化氢10min以抑制内源性过氧化物酶,蒸馏水洗3min。(2)抗原修复:传统法(A组):在进行切片准备的同时,在高压锅内加入EDTA修复液(pH9.0)(保证所加修复液足够多而不使组织干燥),待锅内修复液水热后直接放入处理好的切片,盖上压力阀,从压力阀喷气开始计时,3分钟后离开热源终止修复。改良法(B组):在进行切片准备的同时,将高压锅内加入自来水,在水面上方放置一筛状蒸格,将盛有EDTA修复液(pH9.0)的立式塑料染色缸放于高压锅的蒸格上,待修复液变热后,将处理好的切片放入修复液内,盖上压力阀,从压力阀喷气时开始计时10min。待10min后,离开热源终止修复。(3)染色:切片自然冷却至室温后,采用不含生物素的ENVision二步法进行免疫组化染色。PBS洗3次各3min,滴加第一抗体,37℃1h,PBS洗3次各3min,滴加第二抗体,37℃30min,PBS洗3次各3min,DAB显色5min,苏木素复染,封片。PBS代替一抗作空白对照,以正常乳腺导管上皮为阳性对照。1.4ki-97检测ER免疫组化染色以细胞胞核呈清晰棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达,在待测组织内选取5个代表性的视野(100倍),评估肿瘤细胞中阳性细胞的平均着色强度,其表达强度参照半定量积分法标准进行评分。(1)阳性细胞百分率:<1%阳性细胞为0分、1%～10%为1分、11%～50%为2分、>50%为3分。(2)染色情况:显色深浅不一或显色不清为0分;浅黄色为1分;棕黄色为2分;深褐色为3分。两者相加为综和评分:0分-1分为阴性(-);2分～3分为弱阳性(+);4分～5分为中度阳性(++);>5分为强阳性(+++)。Ki-67以肿瘤细胞核内出现棕黄色作为判断标准。在待测组织内选取5个代表性的视野(100倍),同一医生计算阳性率(肿瘤细胞中的阳性细胞数/瘤细胞总数)根据表达水平分为25%以下、>25%～50%、>50%～75%、>75%～100%这4个级别。对极少数非肿瘤细胞的着色,不计入计数范围。1.5统计处理用SPSS17.0统计数据,计数资料采用χ2检验,P<0.05记为差异有统计学意义。2改良后的染色效果ER显色,两组染色背景无明显差异,B组与A组相比,共有13例发生改变,其中11例由A组的(+)变为B组的(++),有2例由A组的(++)变为B组的(+++),其余的病例在两种方法中无改变。A组的部分(+)的病例,经改良后的综合评分达到了(++),使B组的(++)例数比A组有明显提高,(+)、(++)的结果差异有统计学意义(χ2=4.57,P<0.05),结果见表1。两组不同方法染色效果比较,B组好于A组(见图1、图2)。Ki-67显色,两组染色背景无明显差异,B组与A组相比,80例中有52例基本一致,其余28例的表达水平有不同程度的提高,其中20例由(<25%)变为(≥25%～50%),有6例由(≥25%～50%)变为(≥50%～75%),2例由(≥50%～75%)变为(≥75%～100%),两组结果总体差异有统计学意义(χ2=13.965,P<0.05),结果见表2。两组不同方法染色效果比较,B组好于A组(见图3,图4)。3两种方法的对比免疫组化技术的应用的突破,得益于抗原修复方法的进展,抗原修复的确切原理尚不十分清楚,根据国内外文献报道,推测可能是:1、溶解、洗脱变性蛋白;2、水解作用;3、微波场内离子或极性分子直接碰撞的修复作用。自从Shi发现了抗原热修复以来,抗原热修复得到了极大发展,这是免疫组织化学发展史上的一个里程碑。福尔马林固定液是最广泛应用的固定液,而对于在免疫组化过程中因福尔马林固定引起的抗原封闭问题,目前公认的方法就是必须进行抗原热修复,打开引起抗原封闭的醛键、羟甲键以及醛交联蛋白,以便更充分地暴露出抗原,增强信号。而高温高压热修复法是对大多数抗原修复最为稳定和有效的方法之一。由于没有一种抗原修复液能同时满足多种抗原修复的最佳效果,在实际操作中,我们结合本科室的情况,对抗原修复方法进行了一些改动,尝试使用高压锅改良修复法,以便能方便准确地得出免疫组化结果。我们选取ER和Ki-67这两种常用的有半定量意义的抗原,通过对两种抗原修复方法检测结果的对比,探讨两种方法在ER和Ki-67这两种核抗原的检测上在阳性率、着色强度等方面是否有不同影响。本实验表明,两组修复方法在ER和Ki-67这两种核抗原的检测上表达水平有明显差别,结果显示部分组织用改良高压锅修复法的抗原表达水平好于高压锅传统修复法,ER抗原的表达水平80例有13例提高,(+)和(++)样本阳性率结果差异有统计学意义(P<0.05),Ki-67抗原的表达水平80例有28例提高,差异有统计学意义(P<0.05)。由于大多数医院的组织固定无法达到标准化,受到固定时间或固定液的量不够、固定液浓度和pH值不标准、固定后处理不恰当等因素影响,还有一些需要会诊的陈旧性蜡块的抗原也有不同程度的丢失,因此传统的高压修复法对于部分有问题的组织修复效果不理想,我们在已有文献推荐的传统高压锅修复方法和修复时间(2min～5min)的基础上,经过多次反复试验,在高温高压环境中进行水浴修复,逐步延长修复时间在8min～15min。过去有观点认为,高压锅内修复时间大于3分钟会出现背景染色,但我们发现,随着一抗特异性的提高和非生物素显色试剂套装的使用,适当增加时间并不会引起背景染色的加深。因为热修复在暴露抗原的过程中,会增强内源性生物素的反应,如果使用的是卵白素-生物素检测系统,就会出现假阳性,因此我们使用不含生物素的Envision二步法,避免了生物素引起的假阳性表达。另外,我们在热修复的时间上进行控制,时间控制在15分钟内,切片中未出现假阳性的现象。经过改进后的方法,对于正常及固定有问题的组织均能达到满意效果。出现修复效果差别的原因可能是由于改良法与传统法相比受热更均匀、温度和压力更稳定,修复时间稍长,所以显色信号也更好,这一点与部分学者观点相同。另外,传统法是把修复液直接放入高压锅内,改良法是把修复液放入染色盒中,在修复少量切片时,改良法节省了修复液