3种脱蛋白方法对蜘蛛香多糖总抗氧化能力的影响

3种脱蛋白方法对蜘蛛香多糖总抗氧化能力的影响

蜘蛛虱子。多糖是机体内重要的生物大分子,研究表明多糖的抗氧化活性可能是其抗肿瘤、抗衰老、抗感染等功能的作用机制之一。为深入研究蜘蛛香多糖的抗氧化作用,须制备高纯度产品。蛋白质是粗多糖的主要杂质之一,脱蛋白研究对多糖纯化具有重要意义。粗多糖脱蛋白研究中,一般仅考察蛋白质脱除率和多糖损失率的变化,而忽视脱蛋白方法对多糖抗氧化活性的影响。本实验以蛋白质脱除率、多糖损失率和总抗氧化能力损失率为指标,研究Sevag法、三氯乙酸法和盐酸法对蜘蛛香多糖的影响,为纯化高抗氧化活性蜘蛛香多糖奠定基础。1抗氧化能力测试试剂蜘蛛香购于十堰市中药材公司,产地湖北,经郧阳医学院基础医学院唐微副教授鉴定;考马斯亮蓝G-250(美国Amresco公司);牛血清蛋白(美国Sigma公司);总抗氧化能力测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);其他试剂为国产分析纯。HH·SY11-Ni型电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司);RE-52D型旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂);722S型可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);PHS-25型酸度计(上海雷磁仪器厂)。2方法2.1粗多糖的制备药材烘干,粉碎,过40目筛,加入15倍85%乙醇,回流脱脂2h,抽滤并用85%乙醇洗6次,烘干备用。药粉加水(料液比1∶10),于100℃浸提2次,每次5h,提取液浓缩至1/10体积,加入4倍90%乙醇,4℃静置8h,4000r·min-1离心10min,沉淀依次用乙醇、丙酮、乙醚洗涤,干燥得粗多糖。称取3.75g粗多糖加水溶解并定容至500mL,得蜘蛛香粗多糖溶液。2.2牛血清蛋白标准曲线以考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量。以牛血清蛋白(100mg·L-1)作标准曲线,牛血清蛋白质量分数为横坐标,595nm吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得线性回归方程Y=0.007X+0.0086,r=0.9992。2.3标准曲线的绘制以蒽酮-硫酸法测定多糖含量。以葡萄糖(100mg·L-1)作标准曲线,葡萄糖质量分数为横坐标,620nm吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得线性回归方程Y=0.007X-0.001,r=0.9997。2.4抗氧化能力测试采用铁还原(FRAP)法测定多糖总抗氧化能力。抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+,后者可与菲啉类物质形成稳定的络合物,通过比色法可测出其抗氧化能力的高低。按总抗氧化能力测定试剂盒说明书准备工作液,按试剂盒操作表(见表1)操作,520nm处测定吸光度。在37℃时,每min每mL样品液使反应体系的吸光度值每增加0.01,为一个抗氧化能力单位。2.5多糖质量分数式中,P1,R1,O1分别为原多糖液蛋白质质量分数、多糖质量分数和总抗氧化能力;P2,R2,O2分别为脱蛋白后多糖液蛋白质质量分数、多糖质量分数和总抗氧化能力。2.6利用三氯甲烷和0.4倍体积正丁醇对全球视野的测定取粗多糖溶液75mL于250mL锥形瓶中,加双蒸水稀释至150mL,加入0.2倍体积三氯甲烷和0.04倍体积正丁醇,磁力搅拌30min,4000r·min-1离心10min,取少量上层清液进行测定,剩余上层清液再加入0.2倍体积三氯甲烷和0.04倍体积正丁醇,重复处理数次。2.7三氯乙酸质量分数的测定取粗多糖溶液10份各20mL于50mL烧杯中,以1:1体积加入三氯乙酸溶液,使其质量分数分别为1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,搅匀,4℃静置12h,4000r·min-1离心10min,上清液定容至50mL进行测定。2.8测定方法取粗多糖溶液6份各20mL于50mL烧杯中,分别加入20mL双蒸水并用0.2mol·L-1盐酸调pH至2,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,混匀,4℃静置12h,4000r·min-1离心10min,上清液定容至50mL进行测定。3结果3.1去除蛋白质对多糖结构的破坏Sevag法是利用一定比例的三氯甲烷和正丁醇使蛋白质变性乳化,离心后变性蛋白质处于水相和有机相之间,可温和地除去蛋白质,对多糖结构的破坏较小。由图1可知,Sevag法蛋白质脱除率随处理次数增加显著升高,多糖损失率和总抗氧化能力损失率缓慢升高。Sevag法处理6次后粗多糖蛋白质脱除率达最高为41.71%,多糖损失率为46.38%,总抗氧化能力损失率为11.62%,多糖损失率远高于总抗氧化能力损失率,说明损失的多糖抗氧化能力较低。3.2氯乙酸质量分数对多糖抗氧化能力的影响三氯乙酸为有机酸,可使蛋白质变性并结合生成不溶性的盐类。由图2可知,三氯乙酸法的多糖损失率较低,三氯乙酸质量分数为1%时,多糖损失率为2.71%,质量分数为6%时,多糖损失率达最高为6.53%。三氯乙酸质量分数对多糖总抗氧化能力影响较大,质量分数为1%时,总抗氧化能力损失率为9.96%,质量分数升至10%时,总抗氧化能力损失率达最高为64.73%,说明高质量分数三氯乙酸对多糖活性结构破坏严重。三氯乙酸质量分数为7%时,蛋白质脱除率达最高为48.84%,多糖损失率为4.72%,总抗氧化能力损失率为58.09%。3.3抗氧化能力损失率由图3可知,用盐酸调节多糖溶液pH值,随着pH值降低,蛋白质脱除率逐渐升高,多糖损失率变化不大,总抗氧化能力损失率逐渐增高。pH值为2时,蛋白质脱除率达最高为45.38%,多糖损失率为6.73%,总抗氧化能力损失率为20.75%。3.43不同方法的结果的比较4脱蛋白及抗氧化活性评价多糖组成复杂,种类繁多,生物学活性差异较大,如何分离纯化得到高纯度、高活性的多糖是多糖研究的难题。李贵荣研究发现纯化后的枸杞多糖清除活性自由基能力低于粗多糖。许多多糖产品仅仅停留在保健品阶段,未能开发成药物,主要原因是多糖的分离纯化困难,国内一度出现了“多糖越纯,活性越小”的论点,这是因为用了错误的分离方法。脱蛋白为多糖纯化的重要环节,若仅以蛋白质脱除率和多糖损失率为指标选择脱蛋白方法难以获得高活性多糖。本实验以蛋白质脱除率、多糖损失率和总抗氧化能力损失率综合考察常用的3种脱蛋白质方法对蜘蛛香多糖的影响,发现三氯乙酸法和盐酸法的蛋白质脱除率和多糖损失率指标均优于Sevag法,但这两种方法导致多糖总抗氧化能力损失较大,可能在酸性条件下抗氧化多糖结构易被破坏;Sevag法对蜘蛛香多糖总抗氧化能力影响最小,不仅脱除蛋白质也能去除一些抗氧化活性较低的多糖,利于蜘蛛香抗氧化多糖的纯化,但其蛋白质脱除率仅为41.71%,要进一步脱除蛋白质其工艺还需优化。中药成分抗氧化活性评价的方法有二苯代苦味酰基自由基(DPPH)法、硫代巴比妥酸(TBA)法、FRAP法和生物发光法等。本实验采用简单的FRAP法评价多糖的抗氧化能力,以期简便地筛选出合适的脱蛋白方法,为高抗氧化活性多糖的纯化提供新的思路。由图4可知,若仅考虑蛋白质脱除率和多糖损失率,三氯乙酸法明显优于Sevag法和盐酸法,但其总抗氧化能力损失率最高,