hplc法同时测定不同产地蜘蛛香药材中4种成分的含量

hplc法同时测定不同产地蜘蛛香药材中4种成分的含量

蜘蛛香是蔷薇科植物谢夫肯纳的干燥根系和根茎。具有理气、止痛、消食、除湿、镇静人心等功效。现代研究发现,蜘蛛香中主要含有环烯醚萜类、挥发油类和黄酮类等化学成分,其中环烯醚萜类成分具有抗焦虑、镇静催眠、抗肿瘤等生物活性。2010版《中国药典》将缬草三酯和乙酰缬草三酯作为其含测指标,但此类化合物不稳定,易发生降解。1968年,ThiesPW等首次从蜘蛛香中分离出缬草三酯的代谢产物baldrinal(缬草醛),并测定出其结构。此后,新的环烯醚萜类成分从蜘蛛香中陆续被分离出来。宋歌采用乙醇加热回流提取,通过硅胶柱色谱法,得到了蜘蛛香中缬草三酯类化合物的另一降解产物——11-ethoxyviburtinal。研究表明,蜘蛛香中缬草三酯类成分具有明确的镇静活性,其降解产物缬草烯酸和缬草醛的镇静活性优于其前体产物。在德国,也将baldrinal作为缬草的标示成分之一。4种化合物的化学结构式见图1。在蜘蛛香药材中缬草三酯类化合物及其降解产物同时存在,为深入研究蜘蛛香的药理活性成分及其质量标准,首先需建立该类化合物的含量测定方法。本课题组同时测定蜘蛛香中缬草三酯、乙酰缬草三酯及其降解产物baldrinal、11-ethoxyviburtinal的含量,为蜘蛛香药材的质量控制和进一步开发利用提供依据。1设备和材料1.1反应及设备AgilentLC1100型高效液相色谱仪(DAD检测器、四元泵、在线脱气机、LC1100英文工作站,美国安捷伦公司);KH5200D型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);SSAARRTTOORRIIUUSS--CPA225D型电子分析天平(德国赛多利斯股份有限公司)。1.2urticalpa/乙腈、甲醇的含量缬草三酯、乙酰缬草三酯、baldrinal和11-ethoxyviburtinal均为自制标准品,HPLC法测定其纯度均大于95%;乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);甲醇(色谱纯,美国Fisher公司);娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯(北京化工厂)。1.3败酱科草属植物必关联植物柠蛛香的干燥14个蜘蛛香药材样品分别采集或购自云南师宗、云南大理、云南永平、云南昆明、云南昆明菊花村、云南红河、云南宝山、云南省药物研究所、河北安国、四川雅安、四川峨眉山、四川成都荷花池、重庆药材市场和陕西咸阳,经北京中医药大学石晋丽教授鉴定为败酱科缬草属植物蜘蛛香(V.jatamansi)的干燥根及根茎。2方法和结果2.1柱温度和检测波长色谱柱:AgilentZORBAXSB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm,美国安捷伦公司);流动相A:水,流动相B:乙腈,梯度洗脱:0-5min,30%-55%(B);5-15min,55%(B);15-20min,55%-75%(B);20-30min,75%-80%(B);30-40min,80%(B);40-45min,80%-95%(B);45-50min,95%(B);流速:1mL·min-1;柱温:25℃;检测波长:241nm;进样量:10μL。该色谱条件下,蜘蛛香药材中缬草三酯、乙酰缬草三酯、baldrinal和11-ethoxyviburtinal与其他组分均能达到较好的分离(见图2)。2.2baldrenal、11-ethortical和11-ethoxiviburtnal的最大吸收波长通过对4种单体化合物的全波长扫描,可知缬草三酯和乙酰缬草三酯的最大吸收波长为254nm,而baldrinal、11-ethoxyviburtinal的最大吸收波长为227、241、289和424nm,本实验分别考察了上述5个波长,发现在241nm处,4种化合物均有较大的吸收,因此本实验以241nm作为检测波长。4种化合物的全波长扫描图见图3。2.3储备液的制备精密称取缬草三酯、乙酰缬草三酯、baldrinal、11-ethoxyviburtinal对照品适量,分别加甲醇制成浓度为4.213、1.539、5.105和2.520mg·mL-1的储备液。分别精密吸取缬草三酯、乙酰缬草三酯、baldrinal、11-ethoxyviburtinal对照品溶液0.15、1、1和1mL,置于5mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,定容,制成含缬草三酯、乙酰缬草三酯、baldrinal、11-ethoxyviburtinal浓度分别为0.126、0.308、1.021和0.504mg·mL-1的混合对照品储备液。2.4供试品溶液的制备取蜘蛛香药材(干燥粉碎后过40目筛)各5.0g,精密称定,加入甲醇100mL超声提取(功率200W,频率40kHz)2次,每次40min,合并药液,过滤,滤液浓缩至5mL,置10mL容量瓶中,稀释定容,过0.22μm的有机滤膜,作为供试品溶液。2.5标准品母液的配制分别精密吸取缬草三酯、乙酰缬草三酯、baldrinal、11-ethoxyviburtinal对照品溶液5、5、0.6和0.2mL,挥去部分溶剂,置5mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,作为标品母液。将标品母液分别用甲醇逐级稀释2、4、10、20和40倍。连同母液共配制成6个不同浓度的混合标准品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样分析。以峰面积y为纵坐标,进样量x(μg)为横坐标,得到4种成分的回归方程和相关系数,结果见表1。由表1可知,4种成分在相应范围内线性关系良好。2.6仪器精密度试验取“2.3”项下的混合对照品溶液,连续进样6次,计算得4种成分的峰面积RSD分别为1.60%、1.67%、1.05%和1.89%,表明仪器的精密度良好。2.7重复性试验取重庆药材市场的蜘蛛香药材,按“2.4”项下方法,平行制备6份供试品溶液,测定峰面积,测得4种成分的RSD分别为0.65%、0.43%、1.61%和1.79%,表明该方法的重复性良好。2.8溶液稳定性测定取重庆药材市场的蜘蛛香供试品溶液,分别于制备好后的0、4、8、16、24、48h测定峰面积,得供试品溶液中4种成分在48h内的峰面积RSD分别为1.89%、0.73%、1.86%和1.01%,表明供试品溶液在制备好后的48h内稳定。2.9供试品溶液的制备取6份已知含量的重庆药材市场蜘蛛香药材各约1g,精密称定,分别加入稀释10倍的缬草素对照品溶液1mL、乙酰缬草素对照品溶液0.3mL、稀释100倍的baldrinal对照品溶液1mL、稀释100倍的11-ethoxyviburtinal对照品溶液2mL,按“2.4”项下方法,制备6份供试品溶液,测定其峰面积,结果见表2-5。2.10按标准曲线计算含量取14个不同来源的蜘蛛香药材,按“2.4”项下方法,分别制备供试品溶液,按标准曲线计算含量,结果见表6。由表6可知,14个样品中4种成分的含量差异均很大,缬草三酯、乙酰缬草三酯、baldrinal的含量均以云南宝山蜘蛛香为最高,11-ethoxyviburtinal的含量以云南大理蜘蛛香为最高。3不同产地相关药材中部分成分含量的检测蜘蛛香中缬草三酯类成分具有明确的镇静活性,但该类成分不稳定,其结构中有许多活泼的官能团,在酸、热、光的影响下,易发生开环、断键和某些重排反应而降解,若将该类成分溶解在纯甲醇中,置冰箱中冷冻保存,则稳定性良好。因此本实验选择超声法提取药材,减小了回流提取法中加热等因素对该类不稳定成分的影响。baldrinal、11-ethoxyviburtinal为缬草三酯类成分的降解产物,呈黄色油状物质。研究表明该类降解产物在镇静活性方面远强于缬草三酯,且稳定性也更优,故许多学者认为此类降解产物具有深远的研究价值。本实验首次选择此2种降解产物baldrinal、11-ethoxyviburtinal,与药典规定的检测项目缬草三酯、乙酰缬草三酯一起作为含量测定的指标,建立一种含量测定的方法,并应用该方法同时测定14个不同来源的蜘蛛香药材中4种成分的含量。结果显示,本实验所建立的方法精密度、重复性、稳定性良好,适用于蜘蛛香药材中4种成分的含量测定。14个产地中各成分的含量检测结果显示,各产地4种成分含量差异均很大,缬草三酯、乙酰缬草三酯、baldrinal的含量均以云南宝山蜘蛛香为最高,11-ethoxyviburtinal的含量以云南大理蜘蛛香为最高。从采集时间上看,新鲜药材中缬草三酯、乙酰缬草三酯的含量明显高于贮存时间较久的药材,可能是由于该类成分的不稳定性所引起,通过与课题组前期研究比较,