恩施产野生与栽培蜘蛛香品种质量评价研究

恩施产野生与栽培蜘蛛香品种质量评价研究

蜘蛛香是指失败的煎剂植物的蜘蛛香valenajatamansiya车辆管理的干燥枝条和根。性味辛、苦,温,具有理气和中、散寒除湿、活血消肿的功效,主要用于治疗脘腹胀痛、呕吐泄泻、风寒湿痹、小儿疳积、脚气水肿、跌打损伤等症。其化学成分主要是挥发油、环烯醚萜、黄酮及其他一些成分。现代药理研究表明,蜘蛛香有镇静、催眠、抗焦虑、抗肿瘤等药理作用。蜘蛛香主要分布在云南、湖北、贵州等偏远山区,其中湖北恩施自治州各县市资源丰富。随着蜘蛛香药用价值的日益提高,其野生资源已难以满足市场需求,开展野生蜘蛛香转家种的研究迫在眉睫,本课题组通过其根茎无性繁殖,对其野生转家种技术进行初步研究,培育了不同生长年限的栽培品,从其产量及外观性状上观察,二者并无较大差异,但是有关其栽培品的品质评价尚无定论。因此,课题组分别收集不同栽培年限的蜘蛛香与野生蜘蛛香,从其性状、鉴别、化学成分分析、指标性成分定量测定等方面进行质量评价,以期对野生品种与栽培品种进行科学评价,探讨野生转家种的可行性,也为蜘蛛香栽培技术的推广应用提供技术支持。1试剂和样品1.1色谱柱及色谱柱Angenlent1200高效液相色谱仪;BP121S型电子天平(北京Sartorius天平有限公司,十万分之一);显微镜(上海炳宇光学仪器有限公司),DiamonsilC-18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)。缬草三酯(纯度>98%,成都植标化纯生物科技有限公司,110756-200110)、橙皮苷(纯度>98%,中国药品生物制品检定研究院,110721-200512),乙腈、甲醇(色谱纯,美国Fisher公司),超纯水(实验室自制),其余试剂均为分析纯。1.2未固结物的干燥实验用蜘蛛香药材分别来自湖北省恩施州利川市、宣恩县、巴东县、咸丰县、建始县等5个县市,每个县市各有栽培品与野生1个批次,共计10个批次,野生与栽培品经中药鉴定教研室朱敏英教授鉴定为败酱科植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones的干燥根茎和根,来源见表1。2方法和结果2.1断裂2.1.1芦头平截,叶属单一,2本品根茎呈圆形或扁圆形,略弯曲,不分叉,长3~5cm,直径为0.5~1.6cm,棕褐色或茶褐色,表面有绸密的环纹突起,不甚规则,底面有须根痕。芦头平截,可见茎、叶残基。质坚实,断面黄褐色。下侧具多数须根,多卷缩弯曲。味略苦、辛质坚脆,易折断,断面浅绿色。2.1.2茎基残穴分析本品根茎呈扁圆柱形,略弯曲,不分叉,长2~6cm,直径为0.6~1.7cm,茎基残穴处稍膨大,表面褐色,表面有较绸密的环纹突起,不甚规则,底面有多数须根痕,须根多卷缩弯曲。味略苦、辛,质坚脆,易折断,断面浅绿色。栽培品种主要特点:个头较野生品大、颜色较浅、茎基残穴处膨大、底面须根甚多。2.2识别标记2.2.1圆形单纹孔结构野生与栽培品一致。本品粉末灰褐色,置显微镜下观察发现淀粉粒众多,类圆形,脐点裂缝状,有的可见层纹;复粒由2~4粒组成。易见含黄棕色内含物与油滴的薄壁细胞碎片。根毛为单细胞与多细胞组成。木栓细胞淡黄色,多角形。导管多为网纹导管和单纹孔导管。薄壁细胞内含有橙皮苷结晶和淡棕褐色物。2.2.2薄层色谱测定分别取本品野生与栽培品粉末1g,加乙醚10mL,振摇,放置5min,滤过,滤液挥去乙醚,残渣加甲醇0.5mL使溶解,作为供试品溶液。另取缬草三酯对照品,加甲醇制成每1mL各含1mg的对照溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液5μL、对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以石油醚(30~60℃)-丙酮(5∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。野生品与栽培品显色斑点没有明显差异。2.3综合分析2.3.1乙腈-水萃取KromasilC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,0~20min,10%~55%乙腈,20~60min,55%~95%乙腈。体积流量0.8mL/min,柱温30℃,检测波长254nm。2.3.2黄酮类化学成分见图1。图1中的12号峰(缬草三酯)为参照峰,野生品与栽培品化学成分比较没有明显差异,根据特征图谱共有峰标记,显著差异峰主要集中在3、4号峰,根据极性较大的黄酮类成分与极性较小的环烯醚萜类成分主要集中在图谱的首尾段,观察发现野生品与栽培品在首尾段无显著差异,说明影响其药效的主要化学成分一致,主要差异集中在中间段。2.4重量测试2.4.13草三醇的含量2.4.1.流动相及检测波长以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-水(60∶40)为流动相;检测波长为256nm。理论板数按缬草三酯峰计算应不低于5000。2.4.1.2.对照溶液的制备取缬草三酯对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含缬草三酯0.1096mg的溶液,即得。2.4.1.超声处理法分别取野生与栽培品粉末(过三号筛)约2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50mL,密塞,称定质量,超声处理(功率500W,频率28kHz)30min,取出,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。2.4.1.线性范围检测分别精密吸取缬草三酯对照品2、5、10、15、20μL注入液相色谱仪,按照2.4.1.1项色谱条件下检测峰面积,同一进样体积连续测3次取平均峰面积,以进样量为横坐标x,以平均峰面积为纵坐标y进行线性回归,即得线性关系为y=194.09x+12.729,r=0.9996,线性范围为0.2192~2.192μg。2.4.1.5.准确度研究2.4.1.进样稳定性测定将“批次1”供试品溶液室温下放置,分别于第0、2、4、6、8、12h进样测定,计算缬草三酯色谱峰峰面积RSD值为2.40%(n=5),表明缬草三酯在12h内稳定。2.4.1.对照品溶液的制备分别称取6份供试品约0.5g,加入与“批次1”供试品缬草三酯含有量相当的同一对照品溶液,分别制备6份样品。分别测定,平均加样回收率为100.93%,RSD为3.37%(n=6)。2.4.1.供试品溶液制备称取不同来源的野生品与不同生长年限的栽培品蜘蛛香药材粉末各2g,按照2.4.1.3项下供试品制备方法制备,依次进样10μL,按照2.4.1.1项色谱条件测定各供试品峰面积,外标法计算。图谱见图2。2.4.2黄酮与总草三酯的体积相比2.4.2.标准工作曲线准确称取橙皮苷和缬草三酯对照品适量,分别加甲醇溶解配制成质量浓度为0.1106mg/mL和0.1096mg/mL的标准溶液。分别移取上述标准液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置于10mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,以甲醇作空白,分别于最大吸收波长284nm和256nm处测吸光度。以吸光度A对标准溶液质量浓度C作图,即得标准工作曲线分别为Y=0.035x-0.006,r=0.9993,线性范围为5.53~27.65μg/mL;Y=31.427x+0.0372,r=0.9992;线性范围为2.19~27.4μg/mL。2.4.2.总黄酮和草三酯供试品溶液的制备分别称取2g已脱脂和未脱脂处理的野生和栽培蜘蛛香粉末各3批次,分别加入50mL甲醇溶剂,密塞,摇匀,超声提取1次,30min/次,取出放冷,离心分离,取上清液于旋转蒸发器上浓缩至干,加30mL甲醇溶解,滤去不溶物,滤液加甲醇定容至50mL,即得总黄酮和缬草三酯供试品溶液。分别移取0.2mL供试品溶液,加甲醇定容至10mL,以甲醇作空白,分别于284nm和256nm处测吸光度。并根据标准曲线计算蜘蛛香总黄酮和缬草三酯量。2.4.2.橙皮苷和草三酯rsd的测定取橙皮苷和缬草三酯对照品适量,以甲醇作空白,分别于284nm和256nm处测吸光度,连续测定5次,计算橙皮苷和缬草三酯RSD分别为3.14%和2.89%(n=5)。2.4.2.对照品稳定性测定将橙皮苷和缬草三酯对照品溶液室温下放置0、2、4、6h,以甲醇作空白,分别于284nm和256nm处计算橙皮苷和缬草三酯对照品吸光度的RSD值,分别为1.98%和1.87%(n=4),表明橙皮苷和缬草三酯在6h内稳定。2.4.2.加样回收及加样回收率称取“批次1”已知总黄酮和总缬草三酯含有量的蜘蛛香供试品6份,分别加入等量的橙皮苷和缬草三酯对照品,以甲醇作空白,分别于284nm和256nm处测吸光度,计算平均加样回收率分别为96.31%和95.74%,RSD分别为3.34%和3.21%(n=6)。2.4.3测量结果综上,蜘蛛香栽培品的总黄酮、缬草三酯类成分含有量均高于野生品。3指标性成分量比野生品品质强3.1野生蜘蛛香与栽培蜘蛛香的外观性状无明显差异,显微和薄层鉴别亦未发现明显差异,其特征化学成分分析共有峰均存在,仅在中间段3、4号共有峰上有明显不同,提示野生品较栽培品化学成分复杂,但是差异成分是否是其活性成分还有待商榷;野生品与栽培品的指标性成分含有量比较发现,总黄酮和缬草三酯量后者均高于前者。综上,蜘蛛香栽培品品质在指标性成分含有量上优于野生品。3.2蜘蛛香总黄酮是其抑菌、抗肿瘤作用的主要药效成分,橙皮苷是蜘蛛香黄酮类的主要化学成分,利用它作为标准测定总黄酮不仅测定准确而且具有衡量其质量的意义,已有研究表明家种蜘蛛香中橙皮苷量较野生蜘蛛香高,提示其野生转家种的可行性。缬草三酯类成分具有抗肿瘤、镇静催眠、抗焦虑、解痉等多种药理活性,是其主要活性成分及质量控制指标,蜘蛛香中缬草三酯类成分量的测定方法主要有电位滴定法、比色法、酸碱滴定法。利用紫外分光光度法测定蜘蛛香中总缬草三酯量,方法准确、快速、重复性好、操作简便。蜘蛛香药材集中九月采