蜘蛛香提取物抗惊厥作用的实验研究

蜘蛛香提取物抗惊厥作用的实验研究

蜘蛛香是指打败甘薯科的蜘蛛草科的根。在本主题的早期研究中，发现蜘蛛香具有明显的不适性。其作用方式与5-羟色胺（5-ht）等兴奋性神经盐酸含量有关。本文进一步观察了蜘蛛香乙醇提取物对惊厥小鼠的抗惊厥作用,并通过对脑组织抑制性神经递质GABA和Gly的考察探讨其作用机制。1材料和方法1.1生药中提取率蜘蛛香乙醇提取物:蜘蛛香药材分别加12倍量95%乙醇,30℃超声提取3次,每次50分钟,合并提取液,旋蒸挥去乙醇,用生理盐水配制为分别含生药0.05、0.075、0.1g/ml的低、中、高剂量的药液提取率。艾司唑仑(Estazolam):常州四药制药有限公司,批号071020,经研钵粉碎后,用生理盐水配制为浓度0.075mg/ml的混悬液。以上药物避光4℃保存,使用前混摇均匀。1.2动物清洁级昆明种小鼠,雌雄各半,体重18～22g,四川大学实验动物中心提供,所有动物常规饲养一周后,进行实验。1.3不同时容溶液的制备戊四氮(PTZ):美国Sigma公司,批号P6500,按85mg/kg/d的剂量计算,取PTZ212.5mg定容至50ml,冷藏备用。2,4-二硝基氟苯:成都科龙化工试剂厂;γ-氨基丁酸(GABA)对照品、甘氨酸(Gly)对照品:中国药品生物制品检定所。1.4模型分组及给药小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、艾司唑仑组、蜘蛛香低、中、高三个剂量组共6组,每组8只。其中蜘蛛香低、中、高三个剂量组分别按1.0g/kg/d、1.5g/kg/d、2.0g/kg/d给予蜘蛛香乙醇提取物灌胃0.5ml,艾司唑仑组按1.5mg/kg/d给予艾司唑仑灌胃0.5ml,模型对照组和正常对照组分别灌服等体积的生理盐水,各组连续给药6天。1.5.1小鼠治疗ptz的药物各组连续给药6天,于第6天给药后1小时分别给模型对照组、艾司唑仑组、蜘蛛香高、中、低剂量组小鼠腹腔注射PTZ(85mg/kg)0.5ml。观察并记录15分钟内每组小鼠惊厥潜伏期、惊厥率(以发生点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛为观察指标)及死亡的只数。1.5.2平等测样溶液的配制小鼠抗惊厥实验完成后,立即断头处死,迅速在冰盘上剪开颅盖和脑膜,取小鼠全脑,称重,用甲醇制备脑组织匀浆液,然后于6000rpm离心10min,收集上清液,再用乙腈离心沉淀,除去蛋白,所得上清液即用来测定GABA和Gly的含量。对照品溶液的配制:取GABA0.0046g、Gly0.0054g,置于50ml容量瓶,用甲醇/水(30:70)的溶液定容。2,4-二硝基氟苯溶液的配置:用乙腈配成0.5%的溶液,避光保存。对照品与样品预处理和衍生:取对照品溶液0.2ml,加入2,4-二硝基氟苯溶液、0.5mol/L的NaHCO3溶液各0.2ml,混匀后,于60℃烘箱暗中衍生60min。取样品溶液0.2ml,加入2,4-二硝基氟苯溶液、0.5mol/L的NaHCO3溶液各0.2ml,混匀后,于60℃烘箱暗中衍生60min。色谱条件:色谱柱Mcsphere-C18(200mm×4.6mm,5μm);流动相:A为0.05mol/L的醋酸钠缓冲液(pH=6.5),B为乙腈-水(1:1,V/V),梯度洗脱程序B由初始时的16%经10min增至45%,35min至85%;柱温:30℃;流速:1.0ml/min;检测波长:360nm。2结果2.1对小鼠惊厥的影响对戊四氮致小鼠的惊厥潜伏期、惊厥率和死亡率的影响见表1。表1结果表明,艾司唑仑组小鼠的惊厥潜伏期、惊厥率和死亡率与模型对照组相比皆有非常显著性差异。蜘蛛香中、高剂组惊厥潜伏期与模型对照组相比有延长趋势,但没有统计学差异;蜘蛛香三个剂量组的小鼠死亡率均低于模型对照组,其中高剂组与模型对照组相比有显著差异。2.2不同剂量下蛛蛛香gaba含量对γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)含量的影响见表2。表2结果表明,蜘蛛香低、中、高剂量组脑组织GABA含量均显著高于模型对照组。艾司唑仑组的脑组织Gly含量与模型对照组比较有非常显著性差异,但蜘蛛香三个剂量组与模型对照组相比没有明显差异。3小鼠布氏神经递质中-氨基丁酸、甘氨酸、gly戊四氮(PTZ)是一种中枢神经兴奋药物,单次给予一定剂量戊四氮能迅速引起动物惊厥,目前戊四氮诱导动物惊厥模型广泛应用于抗惊厥药物的研究中。本研究经前期预试,选择一次性腹腔注射PTZ(85mg/kg)0.5ml诱导小鼠惊厥模型,以小鼠发生点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛为惊厥发作指标。发现蜘蛛香提取物对小鼠出现点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛性惊厥的潜伏期有一定延长作用,对惊厥率的发生无明显影响,但高剂量组能明显降低惊厥小鼠的死亡率。γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)是两种重要的中枢神经抑制性神经递质,和睡眠障碍、焦虑、惊厥等病症的发生有非常密切的关系。其中GABA是中枢神经系统分布最广泛的抑制性神经递质,大脑中40%突触是GABA能突触,GABA通过激动GABA受体发挥其抑制作用。研究发现,GABA在阻断兴奋的扩散和传导过程中起决定性作用,GABA的合成减少,可使神经元的抑制