第二章 基因工程的操作过程

第二章基因工程的操作过程C转化子的筛选和鉴定（检）B重组DNA分子的转化和扩增（转、增）ADNA的体外重组（切、接）基因工程的操作过程切接转增检ADNA的体外重组（切与连）同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接粘性末端的更换人工粘性末端的连接重组率同种内切酶生产的粘性末端的连接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BcfIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT不同粘性末端的连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC人工粘性末端的连接5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamHIBamHIEcoRIBamHI人工粘性末端的连接3‘突出末端CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI人工粘性末端的连接平头末端C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT粘性末端的更换BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow补平GATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'

5'EcoRIGGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker重组率重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25%-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。重组率提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：

5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

p5'

GCTTAAOH

5'5'

AATTCG5'

HO退火5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶重组率提高重组率的方法加装同聚尾末端：

CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火C3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

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5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowB重组DNA分子的转化和扩增（转与增）4基因工程的操作过程转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态

转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的制备：挑取单菌落接种LB培养基中，37℃快速振荡过夜。用1/10体积冰冷的100mM

CaCl2溶液悬浮菌体，离心。用1/100体积冰冷的100mM

CaCl2溶液悬浮菌体。用1/10体积冰冷的100mM

CaCl2溶液悬浮菌体，冰浴放置3-24小时，即为感受态细胞。离心收集菌体收集菌体。按1%接种量接种新鲜LB培养基中，37℃快速振荡培养3h。此时，培养物OD600=0.5。转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100ml感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组冰浴放置半小时在42℃保温90秒（热脉冲）快速将转化细胞转移至冰浴中放置2分钟DNA连接液，混匀（体积不超过5μL）加入400μL新鲜培养基，于37℃培养静止培养15min，振荡培养45min（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选

转化的原理与技术细菌原生质体的转化革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子

酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化

转化的原理与技术细菌原生质体的转化不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在含有溶菌酶的高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂细菌原生质体的制备：转化的原理与技术细菌原生质体的转化取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20mlDNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀细菌原生质体的转化：细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素

10×Spizizensalts母液：15%K2HPO4.3H2O，6%KH2PO4，2%(NH4)2SO4，0.2%MgSO4，1%柠檬酸钠，溶于蒸馏水中。GMI：1mL10×Spizizensalts，0.1mL10%酵母粉，0.25mL20%葡萄糖，0.2mL1%水解酪蛋白，0.2mL0.25%所需氨基酸，补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。GMII：1mL10×Spizizensalts，0.05mL10%酵母粉，0.25mL20%葡萄糖，0.04mL1%水解酪蛋白，0.2mL0.25%所需氨基酸，0.05mL0.1mol/LCaCl2，1mL25mmol/LMgCl2，补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。

枯草芽孢杆菌化学转化挑取一新鲜培养的枯草芽孢杆菌单菌落接种于2.5mLGMI培养基中，30℃慢摇振荡培养过夜；将过夜培养物按10%接种量接种于2.5mL新鲜的GMI中，37℃快摇振荡培养3.5h；再将培养物进行第二次传代，接种于5mLGMII培养基中，突变型菌株以10%接种量进行第二次传代，野生型菌株按5%接种量进行第二次传代，37℃快速振荡培养90min；取1mL培养物，5000r/min室温离心5min，用1/10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。枯草芽孢杆菌感受态制备挑取一新鲜培养的枯草芽孢杆菌单菌落接种于2.5mLGMI培养基中，30℃慢摇振荡培养过夜；将过夜培养物按10%接种量接种于2.5mL新鲜的GMI中，37℃快摇振荡培养3.5h；再将培养物进行第二次传代，接种于5mLGMII培养基中，突变型菌株以10%接种量进行第二次传代，野生型菌株按5%接种量进行第二次传代，37℃快速振荡培养90min；取1mL培养物，5000r/min室温离心5min，用1/10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。枯草芽孢杆菌质粒转化取质粒加至感受态细胞悬液中，至终浓度1μg/mL，质粒体积不超过感受态细胞悬液体积的1/20，混匀。37℃水浴中静置30～60min，37℃200r/min振荡培养2～4h，涂合适的培养基上进行筛选，每100μL转化体系涂一个平板。在本转化方法中，枯草芽孢杆菌感受态形成的原理可能是：处于增殖分裂旺盛期的枯草芽孢杆菌突然转入营养贫瘠的培养基中，由于营养限制，饥饿诱导枯草芽孢杆菌细胞内发生一系列生理变化，细胞壁和细胞膜形成缺陷，细胞通透性增加，利于外源DNA的进入，同时在钙离子和镁离子充分作用下，提高了其感受态形成率；在钙离子作用下，转化体系中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物，黏附于细胞表面，提高了外源DNA的转化效率。转化的原理与技术l噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养：

将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选转化的原理与技术电穿孔转化将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大

接种B.subtilis于3mlLB培养基中，过夜培养。取2.6ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M山梨醇）中，37℃，200rpm培养至OD600=0.85~0.95。将菌液冰水浴10min，然后5000g，5min，4℃离心收集菌体。用50ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖），重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次。将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中，EP管分装。每60μl感受态细胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。电转仪设置：脉冲电压2.0kv,脉冲时间4.5~5.0ms,电击1次电击完毕取出杯子并立即加入1mlRM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm振荡复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。转化率转化率的定义转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）转化率转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，

经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：

104/107

X10-2=0.1mg载体DNA

考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：

0.1/20%=0.5

mg载体DNA

载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5mg）。转化率转化率的影响因素载体及DNA重组分子方面：

载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低转化率转化率的影响因素受体细胞方面：

受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高转化率转化率的影响因素转化方法方面：

受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例：Ca2+诱导转化0.1ml感受态细胞50ngDNA

转化方法：Ca2+诱导转化106-107/mgDNA

原生质体转化109

个原生质体 50ngDNA

原生质体转化105-106/mgDNA

l-DNA转染107-108/mgDNA

电穿孔转化106-109/mgDNA

转化细胞的扩增扩增操作转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：

Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时原生质体转化后的再生过程

l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作转化细胞的扩增扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定C转化子的筛选和鉴定（检）4基因工程的操作过程载体遗传标记检测克隆DNA序列检测外源基因产物检测C转化子的筛选和鉴定（检）4基因工程的操作过程由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子转化子重组子目的重组子载体遗传标记检测抗药性筛选法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr抗药性筛选法的基本原理：

pBR3224363bpori抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs载体遗传标记检测抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：

先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上

在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为

ApAp+Tc影印挑选重组子

载体遗传标记检测营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法的基本原理：

营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子

载体遗传标记检测营养缺陷型筛选法常见的营养缺陷型筛选标记：

用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法的基本原理：

显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法的基本操作：

pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重组子（Apr+lacZ-）

将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，白色菌落