血管内皮生长因子家族研究进展

血管内皮生长因子家族研究进展

肿瘤的生长和转移取决于肿瘤血管的形成。肿瘤血管生成是一包括血管内皮细胞增殖、迁移及细胞外基质降解的多步骤和复杂的过程。以新生血管为靶点对肿瘤进行生物治疗已成为近几年新的研究热点。目前,鉴定和克隆的与血管生成有关的因子已达30多种,如血管内皮生长因子、血管抑素、内皮抑素等等,在众多与血管有关的因子中,VEGF是迄今鉴定出来的最重要的血管生成因子,可作为肿瘤代谢及转移的标记。1vegf家族的物理和化学特征1.1外显子6编码的残基和vegf-s13-1的变化情况人VEGF-A基因位于染色体6p21.3,全长14kb,由8个外显子、7个内含子组成,编码产物为34～45kD的同源二聚体糖蛋白,亚基之间通过二硫键相连。VEGF-A基因经过转录水平的剪切产生5种VEGF-A的变异体,分别包含121、145、165、189和206个氨基酸。图1显示5种异构体的剪切示意图。VEGF-A165缺乏外显子6编码的残基,是主要效应分子,有肝素结合位点,既可以分泌到细胞外也可以结合在细胞表面或细胞外基质,与基质结合的VEGF-A165经过纤溶酶在C末端的剪切也可以释放出来;VEGF-A121缺乏外显子6、7编码的残基,是一酸性多聚肽,不能与肝素结合,所以是游离蛋白;VEGF-A189和VEGF-A206的碱性很强,与肝素有较强的亲和力,是与细胞外基质(ECM)中硫酸肝素紧密结合的不溶性蛋白;VEGF-A145比较少见。VEGF-A在正常人和动物的组织中表达较少,在有新生血管生成的组织细胞中有高表达,包括胎儿组织、胎盘、黄体,特别在肿瘤中有高表达。许多因素可以提高VEGF-A的表达,如缺氧诱导因子-1(HIF-1),各种生长因子和肿瘤基因包括EGF、TGFα/β、角质细胞生长因子,胰岛素样生长因子-1、FGF、血小板源生长因子等都可上调VEGF-AmRNA的表达。这些因子通过旁分泌或自分泌的方式与局部缺氧共同调节VEGF-A的表达。肿瘤基因突变体或Ras扩增子都可以使VEGF-A上调。另外,炎症反应因子,如IL-1α和IL-6也可以诱导一些细胞表达VEGF-A。1.2vegf-b65的n初始人VEGF-B基因位于染色体11q13上,全长4kb,由7个外显子和6个内含子组成。VEGF-BmRNA经两种不同剪切方式而产生两个不同的转录子,分别编码含167和186个氨基酸残基的蛋白。VEGF-B167和VEGF-B186的分子量分别为21kD和32kD,两者都是以二硫键相连的同源二聚体。VEGF-B167和VEGF-B186的N末端相同;而C末端不同。VEGF-B167的C末端富含碱性半胱氨酸,碱性很高;VEGF-B186的C末端富含疏水性氨基酸。VEGF-B167在肝素或高渗盐溶液的刺激下可分泌到细胞外;VEGFB186可由细胞自由分泌。VEGF-B167的限制性分泌与其C末端的高碱性有关,肝素和高渗盐溶液的结合位点均在其C末端。VEGF-B167-VEGF-A165的异源二聚体形式也是由肝素刺激分泌,故推测VEGF-B167-VEGF-A165的异源二聚体控制着VEGF-A的生物利用度。VEGF-B主要在胚胎及成人的肌肉组织中表达,在许多组织中(主要是心肌)与VEGF-A共同表达,在人类的各种肿瘤细胞中也有表达。与VEGF-A不同的是,VEGF-BmRNA较稳定,在缺血、缺氧、癌蛋白、癌基因刺激下,表达未见增加。1.3vegf-c的表达人VEGF-C基因位于染色体4q34上,VEGF-CcDNA的开放阅读框编码一种含有419个氨基酸残基的蛋白,分子量为46.9kD,这种VEGF-C前蛋白包括一个N端信号肽、VEGF-A的同源区和一个C端前肽。C端的前肽包含4个重复的富含半胱氨酸的结构;VEGF-C的VEGF-A同源区包含3个与N相连的糖基化位点。VEGF-C可以自由分泌到细胞外,其分泌形式是同源二聚体,大多数分泌型VEGF-C是其多肽蛋白前体的水解产物。在许多胚胎和成人组织中探测出两个分子量分别为2.4kD和2.0kD的VEGF-CmRNA。肿瘤细胞特异性地表达2.4kD的mRNA。据Eichmann等研究发现,VEGF-C在淋巴管丰富的区域有明显的表达,与flt-4的表达范围相似。缺氧、癌蛋白等条件并不促进其表达,而血清及其生长因子组分,如PDGF、EGF、TGF-β等均可促进VEGF-CmRNA的表达,延长VEGF-CmRNA的半衰期。一些炎症因子,如IL-1β可呈浓度及时间依赖性地使VEGF-C增加,肿瘤坏死因子(TNF)及IL-1α可增强VEGF-CmRNA表达。1.4两种类型的转录片段人VEGF-D基因位于染色体Xp22.31,全长50kb,由7个外显子和6个内含子组成。它的cDNA序列含有419个碱基对,其中开放阅读框编码一种含有354个氨基酸的多肽。大多数人类组织中可检测到VEGF-DmRNA,转录大小是2.3kb,惟一不同的是在骨骼肌中检测到不甚丰富的2.8kb的转录片段。在VEGF家族中VEGF-D与VEGF-C的结构相似,除了含有一个VEGF同源区外,和VEGF-C一样也有长的C端和N端,C末端富含半胱氨酸残基,在N末端,VEGF-D氨基酸序列有高度疏水区,是蛋白分泌的信号序列特异结构。人类VEGF-D有3个潜在的N-连糖基化位点,有两个在VEGF-C中保留。VEGF-D经过与VEGF-C相同的方式被水解成一种截短的成熟形式分泌出来。VEGF-D与其他VEGF家族成员不同,是惟一受c-fos调控的促血管生成因子,这一独特的调控机制与肿瘤的发生发展有关,而c-fos本身就与多种组织的生长分化甚至恶性转化密切相关。另外细胞间连接可以诱导VEGF-D的产生,TGF-α、betacelluin(BTC)、heregulin-β(HRG-β)通过与表皮生长因子受体结合,下调VEGF-DmRNA。1.5vegf-21氨基酸水平VEGF-E从羊口疮病毒染色体组被分离出来,分子量为20kD,与VEGF-A121在氨基酸水平有25%同源性,缺乏碱性区和肝素结合区。它仅与flk-1结合,与VEGF-A165的生物学作用和效能相似。1.6kd的t-pcr检测人胎盘生长因子(PLGF)基因位于染色体2p16-21,编码产物为46～50kD的同源二聚体糖蛋白。由于转录的不同,它存在两种异构体:PLGF-1及PLGF-2。它们可在几种类型的肿瘤细胞中表达,甲状腺、胎盘、肺及甲状腺肿中也有表达。PLGF-2存在肝素结合区,是一种促血管生长因子。2酪氨酸激酶受体最初在血管内皮细胞上发现了VEGF的受体,接下来在骨髓干细胞表面也发现了VEGF的受体。VEGF-A主要结合在两类酪氨酸激酶受体上,VEGFR-1和VEGFR-2。两者细胞外都有7个免疫球蛋白样结构域、一个跨膜区域和一个酪氨酸激酶序列。VEGFR-3是专一性结合VEGF-C、VEGF-D的受体。除了酪氨酸激酶型受体外,VEGF-A还可与受体Neuropilins(NRP1/NRP2)结合。VEGF家族因子与其相应受体的关系如图2所示。2.1vegfr-1信号通路VEGFR-1是最早发现的VEGF的受体酪氨酸激酶(RTK)型受体,但其功能仍有很大争议,这可能与其在不同细胞型或不同细胞周期所发挥的作用或所调控的信号通路不尽相同有关。HIF-1可以上调VEGFR-1的表达。除了VEGF-A外,VEGFR-1还可以与PIGF、VEGF-B结合。不同的剪切方式会产生可溶性的flt-1,与VEGF-A结合后可抑制其活性。经图谱分析,VEGFR-1与VEGF-A的结合位点在其第二个免疫球蛋白样结构域上,与VEGF-A结合后会发生微弱的自身酪氨酸磷酸化。Park等认为VEGFR-1并不是作为介导有丝分裂信号途径的受体,而是一种VEGF的负调控子,通过与VEGFR-2竞争结合VEGF-A阻断其作用于血管内皮的有丝分裂原作用。PGF可以将结合于VEGFR-1的VEGF-A释放出来而使其发挥作用。这种负调控的作用,可溶性的VEGFR-1也有。Gille等证实在VEGFR-1的近膜区域有一抑制性基元阻断VEGF-PI3激酶的活性。VEGFR-1还可与其他信号通路蛋白发生作用,使PLC-γ及相关蛋白都磷酸化,还诱导钙调蛋白,c-rasGAP(GTPaseactivatingprotein)等的磷酸化,介导细胞间信息传递。Fong等研究表明VEGFR-1在鼠的生长发育早期起到负调控VEGF-A的作用,可以看到先天缺陷VEGFR-1表型的鼠的内皮细胞可以发育但无法形成血管通道,成血管细胞的过度增生是致死的主要原因。但是在缺失VEGFR-1的酪氨酸激酶域后,VEGF-A虽然仍可与受体结合但不会再致死或引起血管发育不完善。VEGF-A引起单核细胞的迁移也是由VEGFR-1的酪氨酸激酶域介导的。近期的研究将VEGFR-1信号通路与诱导肺内皮细胞基质金属蛋白酶(MMP9)表达以及癌细胞向肺的转移联系起来。VEGFR-1在血细胞生成和内皮祖细胞募集中的作用也受到关注。PLGF激活VEGFR-1诱导造血干细胞募集,恢复血细胞生成。VEGFR-1的激活还可以引起旁分泌释放肝细胞生长因子(HGF)、IL-6和其他亲肝分子,这样肝细胞与肝窦内皮细胞共培养就可以增殖。这些发现说明,VEGFR-1信号功能是引起血管内皮细胞释放组织特异性生长因子。2.2vegf-a信号分子的作用VEGFR-2主要介导VEGF-A促有丝分裂,新生血管形成和血管通透性增加效应的受体。在flk-1表型缺陷的小鼠中发现血管生成减少,无法建立血岛,无法形成正常的血管,8.5～9.5日胎死腹中。在完整的细胞中,当配体(VEGF-A)结合到受体上时,受体发生二聚体化、酪氨酸残基磷酸化、激活下游与促有丝分裂、化学趋化性、抗凋亡等效应相关的信号分子,从而发挥作用。VEGF-A可以诱导血管内皮细胞的许多蛋白发生磷酸化,如PLC-γ、PI3激酶、RasGTP酶激活蛋白和Src家族等。VEGF-A诱导血管内皮细胞生长是通过激活Raf-Mek-Erk通路实现的。不同的是激活这条通路不是由常规的Ras,而是由蛋白激酶C实现的。突变VEGF-A使之只能结合到VEGFR-2上,但仍可以发挥完全的促有丝分裂和增加血管通透性的作用,而只能结合VEGFR-1的突变体则无上述两种作用。在人的脐静脉内皮细胞上的VEGFR-2结合了VEGF-A后可以发挥抗凋亡的作用,由PI3-Kinase-Akt通路介导。近期研究表明,在某些情况下,VEGFR-1也可以发挥抗凋亡的作用,是通过诱导抗凋亡基因存活实现的。2.3vegfr-3与肿瘤间质血管VEGFR-3是酪氨酸激酶家族新成员,与其特异的配体VEGF-C、VEGF-D结合可以引起内皮细胞的增殖和迁移,调控血管及淋巴管内皮细胞的新生,对胚胎发育及肿瘤的生长和转移起重要调控作用。在胚胎生长过程中,VEGFR-3对心血管形成起着重要作用,VEGFR-3缺陷的胚胎卵黄膜会出现异常血管网,见不到主动脉干,血管内血细胞减少,胚胎最后因为心血管功能衰竭死亡。正常成人组织中没有VEGFR-3,肿瘤间质血管可以见到其表达,且参与肿瘤血管的形成。VEGFR-3参与保持血管内皮细胞完整性,当内皮细胞遭到破坏,VEGFR-3迅速升高,恢复其完整性,防止血管裂开。VEGFR-3还有一个极为重要的作用是介导淋巴管生成,经研究发现,到胚胎后期,VEGFR-3分布逐步局限于淋巴管,血管几乎不表达。在成人,VEGFR-3也主要表达于淋巴管。VEGFR-3引起淋巴管生成的信号通路为MAPK及RAFTK途径。当VEGF-C或VEGF-D与VEGFR-3结合后,一方面通过SHC/Grb2/SOS激活Ras/MAPK诱导淋巴管内皮细胞有丝分裂,产生细胞增殖效应;另一方面又通过RAFTK信号传导通路产生细胞的粘附效应并促进内皮细胞的迁移及淋巴管的形成。VEGFR-3诱导生成的淋巴管结构不同,由一层极薄的没有基底膜底内皮细胞排列而成,通透性极高,是肿瘤细胞发生粘附,穿入并转移到远处淋巴结的形态学基础。Makinen等发现一种可溶性的VEGFR-3可潜在地抑制VEGF-D的信号转导通路,当其在转基因鼠表皮中表达时,能潜在地抑制鼠胚胎淋巴管的生成,而且能使已形成的淋巴管逐渐消退,但对已形成的淋巴管没有影响。2.4vegfr-2与nrp1的相关性早期研究表明,某些肿瘤和内皮细胞表面VEGF-A结合位点不同于已知的几种受体。VEGF-A121不能结合到该位点,说明外显子7编码的碱性序列是结合到该位点所必需的。Soker等证实这种受体是NRP1,可以与collapsinsemaphorin家族结合,与神经元导向有关。研究表明在VEGFR-2与NRP1共表达的细胞上,NRP1可以增强VEGFR-2介导的信号通路的有效性,所以可以结合NRP1的VEGF-A165比不能与之结合的VEGF-A121促有丝分裂活性高。但目前还未找到结合VEGF-A165后NRP1/2介导的信号通路。3抗vegf的药物治疗原位杂交证实许多肿瘤细胞中VEGFmRNA都高表达。血管内皮细胞不表达VEGF,但肿瘤血管内皮细胞过度表达Flt-1mRNA和KDRmRNA,肿瘤淋巴管内皮细胞过度表达Flt-4。Kim等报道VEGF的抗体可以抑制裸鼠体内肿瘤的生长,后来发现许多抗VEGF的治疗,如应用小分子抑制剂阻断信号传导,用反义寡核苷酸技术,或VEGFR-2的抗体等都可以抑制肿瘤的生长。肿瘤细胞及肿瘤周围基质都可以分泌VEGF,在不表达VEGF的肿瘤细胞中新生血管被抑制。一些研究表明,结合抗VEGF的治疗和化疗或放疗比使用任何单一疗法更有疗效。一些VEGF的抑制剂已进入临床试验,包括抗人VEGF的抗体、抗VEGFR-2的抗体和可以阻断VEGFR-2信号转导的一些小分子抑制剂,以及可溶性的sFlt-1。二期临床数据表明,VEGF的单克隆抗体