第11章 微生物细胞破碎

第二章回顾发酵液的特性预处理的目的改善发酵液过滤特性的方法发酵液的相对纯化影响固液分离的因素过滤（分类、常用过滤器）；离心分离（分类、常见离心分离设备）切向流过滤下一章第十一章微生物细胞破碎许多基因工程产品都是胞内产物（目的基因在宿主细胞内克隆表达成为基因工程产物），细胞破碎是提取胞内物质的关键步骤，因此，细胞破碎技术引起普遍关注。胡萝卜软腐欧文氏菌紫红诺卡氏菌黑曲霉脆壁克鲁维酵母乳酸酵母凝结芽孢杆菌链霉菌属点青霉酿酒酵母菌表3.1(续)

几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病α--干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤概述细胞破碎（cellrupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎主要采用各种机械破碎法和非机械破碎法，或二者的结合。机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力。化学破碎又称化学渗透，利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率；或完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压的作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。第一节细胞壁的组成与结构表3.2各种微生物细胞壁的结构与组成多聚糖（80%—90%）脂类蛋白质葡聚糖（30%—40%）甘露聚糖（30%）蛋白质（6%—8%）脂类（8.5%—13.5%）肽聚糖（5%—10%）脂蛋白磷脂脂多糖（1%—4%）蛋白质肽聚糖（40%—90%）多糖胞壁酸蛋白质脂多糖（1%—4%）主要组成多层多层多层单层层次100—250100—30010—1320—80壁厚/nm霉菌酵母菌革兰氏阴性细菌革兰氏阳性细菌微生物一、细菌细胞壁肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成分，结构为机械性强度很大的网状结构。细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于多糖链上所存在的肽键数量和其交联的程度。交联程度越大，网状结构就越致密，破碎的难度也就越大。革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，网状结构较坚固；革兰氏阴性细菌的网状结构较疏松。二、酵母菌细胞壁酵母菌细胞壁比革兰氏阳性细菌要厚，但不及革兰氏阳性细菌细胞壁坚韧。酵母菌细胞壁破碎的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。霉菌细胞壁霉菌中大多数的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成的。细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁要高。细胞壁结构与细胞破碎破碎细胞必须克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎难易程度的重要因素。细胞个体小，球形，壁厚，聚合物交联程度高是最难破碎的。微生物细胞壁的组成和结构取决于遗传信息、培养的生长环境和菌龄。霉菌的细胞壁结构随培养过程中机械搅拌作用的强弱而变化。所以，通过改变遗传密码或培养的环境因素可改变细胞壁的结构。细胞破碎的原则

需通过实验确定适宜的破碎器和破碎操作条件，获得最佳的破碎效率。在细胞内存在的许多种物质中，选择性释放目标生化物质，而使其他物质尽量少地释放出来，并且尽量降低细胞的破碎程度，在保证目标生化物质有较高收率的前提下，使下游加工过程的成本最低。选择性地释放目标生化物质的关键是要根据目标生化物质的性质和在细胞内存在的位置来选择适当的破碎方法和操作条件。选择性地释放目标生化物质？①仅破坏或破碎存在目标生化物质的位置周围：当目标生化物质存在于细胞膜附近时，可采用较温和的方法，如酶解法、渗透压冲击法和冻结-融化法等。当目标生化物质存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法，产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法。②选择性溶解目标生化物质：当目标生化物质处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调整溶液pH值、离子强度或添加与目标生化物质具有亲和性的试剂如螯合剂、表面活性剂等,使目标生化物质容易溶解释放。所选的溶液体系应使其他杂质不易溶出。第二节常用破碎方法按其是否使用外加作用力可分为机械法和非机械法两大类高速湿法珠磨法和高压匀浆法已经在工业生产中广泛应用，酶解法和化学溶胞法也大量应用于实验室规模的细胞破碎中，超声破碎法和微波破碎法的实验室研究开发相当活跃。表3.3细胞破碎方法分类非机械法

条件变化剧烈，易引起大分子物质失活改变细胞膜的渗透性干燥法破碎率较低，不适合对冷冻敏感的目的产物反复冻结－融化冻结融化法破碎率较低，常与其他方法结合使用渗透压剧烈改变渗透压法具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差改变细胞膜的渗透性化学渗透法具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差酶分解作用酶溶法破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适应固体剪切作用X-press法对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作液体剪切作用超声破碎法可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌液体剪切作用高压匀浆法可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难固体剪切作用珠磨法机械法适应性作用机理分类机械破碎机械破碎处理量大、破碎效率高、速度快,主要靠均质作用和球磨碾磨作用；操作时，细胞遭受强大的机械剪切力而被破碎。采用机械法，发热是一个主要问题其次，不容易规模放大。细胞的机械破碎主要有:珠磨高压匀浆超声波破碎X-press法等方法。珠磨法工作原理是：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径﹤1mm）一起快速研磨或搅拌，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器作用下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。过程中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。珠磨法破碎细胞分为间歇或连续操作。珠体的大小应以细胞大小、浓度以及连续操作时不使珠体带出作为选择依据。珠体的装量要适中。装量少时，细胞不易破碎；装量大时，能量消耗大，研磨室热扩散性能降低，引起温度升高。珠磨法提高细胞破碎率的措施：延长研磨时间、增加珠体装量、提高搅拌转速提高操作温度高破碎率带来的问题:能量消耗大大增加产生较多的热能，增大了冷却控温的难度；大分子目的产物的失活损失增加；细胞碎片较小，分离碎片不易，给下一步操作带来困难。所以，不仅要考虑总收率，而且要兼顾下游过程。珠磨的细胞破碎效率随细胞种类而异，适用于绝大多真菌菌丝和藻类等微生物细胞的破碎。高压匀浆法高压匀浆法的原理是利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度可达几百米（可达到450m/s）。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。操作压力通常为50～70Mpa。影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器的次数。增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎率，但压力增大到一定程度后对匀浆器的磨损较大。高压匀浆法适用于酵母和细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20%左右。高压匀浆法不宜采用高压匀浆法破碎的微生物细胞有：易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，以及含有包含体的基因工程菌，因为包含体质地坚硬，易损伤匀浆阀。高压匀浆器的种类较多：WAB公司的AVPGaulin31MR型，最大操作压力为24MPa，最大处理量为为100dm3/hBranandluebbe公司SHL40型，最大操作压力为20-63MPa，最大处理量为为2.6-34m3/h意大利NiroSoavi-系列高压均质机，最大操作压力为60～150MPa，最大处理量为为20-30m3/h注意事项：高压匀浆器的操作温度上升约２－３℃/10MPa，为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。超声波破碎也是应用较多的一种破碎法，通常采用的超声破碎机在15—25KHz的频率下操作。机理：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。常用的设备为电声超声波发生器，它是由发声器和换能器组成，发声器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器又可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。超声波破碎优点：超声波破碎很强烈，适用于多数微生物的破碎。缺点：A、影响因素多，如声强、声频、温度、时间、离子强度、pH、细胞类型、振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状；B、超声产生超氧离子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、产热大，需控温；E、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。X-press法（撞击破碎）原理：细胞是弹性体，比一般刚性固体粒子难于破碎。将弹性细胞冷冻使其成为刚性球体，降低破碎难度，撞击破碎正是基于这样的原理。操作：X-press法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体（粒径小于50μm），利用500MPa以上的高压冲击（如氮气，流速约300m/s），使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形引起破碎。X-press法（撞击破碎）特点：①细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细胞破碎均匀，可避免反复受力发生过度破碎的现象；②细胞破碎程度可通过无级调节载气压力（流速）控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器（如线粒体、叶绿体等）的回收。③实验室和工业规模均可应用，细胞浓度在10-20%，实验室规模的间歇处理能力在50-500mL/h，工业规模的连续处理在10000mL/h以上。撞击破碎适于微生物细胞和植物细胞的破碎。非机械方法

处理条件一般比较温和，有利于目标生化物质的高活力释放回收，缺点：破碎效率较低、产物释放速度较慢，处理时间较长，多局限于实验室规模的小批量应用。微生物细胞常用的非机械破碎法酶溶法化学渗透法微波破碎渗透压法反复冻结-融化干燥法

等酶溶法利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。分外加酶法和自溶法两种。外加酶法常用的溶酶有溶菌酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶等，细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。外加酶法主要用于实验室规模，是细胞工程进行原生质体融合的常用方法。优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。不足：一是溶酶价格高，限制了大规模应用，回收溶酶则需增加分离纯化溶酶的操作和设备。二是溶酶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确定最佳的溶解条件。三是产物抑制的存在，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用。酶溶法自溶法溶胞酶是由微生物本身产生的。影响自溶的主要因素有温度、时间、pH、激活剂和细胞代谢途径等。微生物细胞的自溶法常采用加热法或干燥法。缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性；自溶后细胞悬浮液黏度增大，过滤速率下降。因自溶法时间较长，常需要添加少量防腐剂（如甲苯、氯仿等）防止细菌滋生和污染细胞壁合成抑制法（青霉素、环丝氨酸、杆菌肽）化学渗透法一些化学试剂可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择的渗透出来。包括：表面活性物质EDTA螯合剂有机溶剂变性剂表面活性物质可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。主要通过破坏内膜的磷脂双分子层而破膜。天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等，合成的表面活性剂可分离子型和非离子型，离子型如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化铵（阳离子型）。非离子型如TritonX-100和吐温（Tween）等。从大肠杆菌中提取L-天冬酰胺酶时，常用2％TritonX-100和12.5％K2HPO4溶液处理菌体，可释放70％以上的酶。EDTA螯合剂处理革兰氏阴性菌，EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，导致内层膜通透性增强。有机溶剂分解细胞壁中的类脂。被吸收进细胞壁的类脂中，使胞壁膜溶胀，进而使细胞破碎。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等变性剂盐酸胍和脲是常用的变性剂。一般认为变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。化学渗透法根据各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合理的搭配使用能有效地提高胞内物质的释放率。优点：对产物释放具有一定选择性。使较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。控制条件可以有选择地释放出位于细胞内不同部位的产物。细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。缺点：通用性差；时间长，效率低(<50%)；有些化学试剂有毒性，其后需设法分离除去。（如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析）微波破碎利用微波场进行细胞破碎的方法。适用于热稳定的生化物质，如多糖、低聚糖、生物碱、黄酮、皂甙等成分，但不适用于热敏性生化物质，如蛋白质、酶和多肽等，也不适用于富含淀粉或树胶的植物。渗透压法将细胞放在高渗透压的介质(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液）中，达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破碎。适用于不具有细胞壁或细胞壁强度较弱细胞的破碎。反复冻结—融化法机理：一、冷冻过程使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性；二、冷冻时胞内水结晶形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。操作：将细胞急剧冻结至－20℃～―15℃，使之凝固，然后在室温缓慢融化，此冻结-融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。缺点：反复冻融会使蛋白质变性，从而影响活性蛋白质的回收率。冻结-融化法适用于比较脆弱的菌体。干燥法有气流干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等方法。通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。酵母菌常用气流干燥，一般在25—30℃的气流中吹干，部分酵母产生自溶，然后用水、缓冲液或其它溶剂抽提。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后故菌体在冷冻条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。有机溶剂干燥法，可将菌体悬浮液慢慢倒入10倍体积预冷至-20℃的丙酮中搅拌，利用丙酮破坏细胞蛋白质和脂类的结合，使细胞脱水，溶解除去膜上部分脂肪，胞内物质就容易被抽提出来。如：无锡酶制剂厂的α-淀粉酶、β-淀粉酶、脱支酶等。干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活性物质变性表3.5机械破碎法与非机械法比较实验室范围实验室、工业范围应用范围成本高成本低经济差强通用性不需专用设备需专用设备设备时间长、效率低时间短、效率高时间、效率低(核酸少）高（核酸多）粘度部分全部内含物释放细胞碎片较大碎片细小碎片大小溶解局部壁膜切碎细胞破碎机理非机械法机械法比较项目包含体的破碎

包含体是一种蛋白质的聚集(合)体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白，其次还有大肠杆菌菌体蛋白和质粒编码蛋白等。这些目标产物在一级结构上是正确的，但在立体结构上却是错误的，因此没有生物活性。一般地，包含体在透视性相差显微镜下为不透明的颗粒，直径可达0.1～3.0μm，性质稳定，难溶于水，仅在变性剂溶液中才能溶解，而且密度较大，有折光性，因此也称为折光体。包含体形成的原因：①少量蛋白产生时是可溶的.其后积聚的量过多，在细胞内超过其溶解度而沉淀，并随诱导时间延长，不溶部分增加。但细胞裂解，并用适当溶剂稀释后，可以转为溶解状态;②蛋白合成太快，肽链来不及形成正常的折叠构象，导致分子间疏水基相互作用聚合而不溶，此时即使稀释也不能溶解，生物活性也受影响;③高表达的蛋白没有形成分子内正常的二硫键连接，这可能是由于肽键来不及形成正常的折叠构象而导致错误的二硫键连接，或者是高表达时细胞内氧化还原等条件不同而生成不同的二硫键连接;④蛋白的溶解需要与其他成分结合或经其他成分诱