第10章经典液相色谱法

经典

液相色谱§1

LSC

§2

LLC§3ICE§4SCE§5TLC§6PC第10章

经典液相色谱法包括经典柱色谱法和平面色谱法，是在常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法。经典色谱法与现代色谱法的区别主要在于输送流动相方式、固定相种类和规格、分离效能、分析速度和检测灵敏度等方面。经典液相色谱法设备简单，操作方便，分析速度快。在药物研究、食品化学、环境化学、临床化学、法检分析及化学化工等领域都有广泛的应用。特别是在天然药物成分的鉴别、分离等方面发挥着独特的作用，是中药鉴别的主要方法之一。

第1节液-固吸附柱色谱法（LSC）

经典的液—固吸附色谱（liquidsolidadsorptionchromatography，LSC）是以吸附剂为固定相，有机溶剂为流动相，利用不同组分在吸附剂上吸附性能的差异，进行分离分析的方法。

用于分离分析极性至弱极性的化合物，不适用于分离分析强极性的物质。一、基本原理1．吸附与吸附平衡吸附是指溶质分子与吸附剂分子之间所存在的某些化学作用力而被吸附在吸附剂的表面。吸附过程则是试样中溶质分子（X）与流动相分子（Y）争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程（图10-1）。图10-1吸附色谱示意图m.流动相a.吸附剂Xm.流动相中溶质分子Ym.流动相分子Xa.被吸附的溶质分子

吸附平衡常数:由于流动相分子是大量的,所以[Ym]/[Ya]可视为常数。

∴（10-2）

为吸附剂的表面积，为流动相的体积，Cs为溶质在固定相的浓度，Cm为溶质在流动相中的浓度。吸附平衡常数K是与组分的性质、吸附剂和流动相的性质与温度有关的一个常数。

K值小，说明该物质被固定相吸附得不牢固，易被流动相分子解吸附，在固定相中滞留时间短，在柱中移动速率快，先流出色谱柱；若K值大，说明该物质被吸附得牢固，在固定相中滞留时间长，移动速率慢，后流出色谱柱，2吸附等温线

一定温度与压力下,某组分在吸附剂表面吸附平衡,该组分在两相中的浓度相关曲线。（1）线性吸附等温线吸附平衡常数K为一定值时，则吸附等温线为线型。即达到平衡时，组分在固定相中的浓度Cs与其在流动相中的浓度Cm

成正比(Cs=KCm)，直线的斜率为K。线型吸附等温线是理想的等温线，同一种溶质的平衡常数K与溶液的浓度无关，即K为一常数。组分流出速度不受浓度的影响，故在洗脱或展开时，同一溶质分子在柱内具有相同的迁移速率，能得到左右对称的流出曲线。如图10-2A所示。（2）凸形吸附等温线在绝大多数情况下，吸附等温线都有些弯曲而呈现凸形吸附等温线。其中主要原因之一是固体吸附剂表面的不均一性。例如硅胶表面上有几种吸附能力不同的吸附中心——强的、较强的、弱的、极弱的

同一溶质分子总是先占据强的吸附中心，两者之间作用力强，溶质分子被吸附得牢，吸附平衡常数K值大，迁移速率慢；后占据弱的吸附中心，两者之间作用力弱，吸附平衡常数K值小，迁移速率快，并依此类推。显然，同一溶质分子具有不同的吸附平衡常数K，即具有不同的迁移速率。在溶质分子集中的区域，吸附剂的所有吸附中心达到吸附饱和，K值小，迁移速率快，先流出色谱柱；在溶质分子稀少的区域，由于仅仅占据了强吸附中心，K值大，迁移速率慢，后流出色谱柱。从而导致流出曲线前沿陡峭，后沿拖尾，形成拖尾峰，且保留时间亦随样品量的增加而减小。如图10-2B所示。（3）凹形：由于进样量较大，影响了固定相的物理性质。随溶质量的增加,Cs/Cm增加，所以呈凹形。吸附等温柱内溶质浓度分布柱内溶质浓度的分布曲线流出曲线保留时间与进样量的关系拖尾峰的出现对以下产生了不利的影响：①利用峰面积进行定量时峰面积的积分精度和重现性。②利用峰高定量时检测的灵敏度。③定性分析时保留值与物质性质的相关性。④组分之间相互分离的程度。因此应尽量避免色谱峰的拖尾。克服的方法是：减小进样量或样品的浓度，即利用凸形吸附等温线的直线部分，从而得到左右对称的流出曲线。二、吸附剂对吸附剂的要求：(1)表面积大，具有一定的吸附能力。(2)不应与流动相发生化学反应。(3)粒度要细，一般要150目。1.吸附剂：常用的有：氧化铝、聚酰胺、硅胶等。酸性pH=5～4

分离酸性物质.如氨基酸(1)中性pH=7.5氧化铝

分离生物碱.如挥发油,甾体等碱性pH=9～10

分离碱性.如生物碱(2)硅胶:吸附能力稍弱于氧化铝,用于分离弱酸与中性物(如有机酸、氨基酸、甾体等)。硅醇基是使硅胶有一定吸附能力的活性基团。

三种存在形式:

吸附能力：Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ活性大小：Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ(3)聚酰胺:由酰胺聚合而成的高分子物质。

其吸附原理利用分子内酰胺基和羰基。

酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中的羟基或羧基形成氢键；

酰胺基中的氨基与醌类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸附作用。不同的化合物，由于活性基团的种类、数目与位置的不同，形成氢键的能力不同，而实现分离。对位间位取代基均能形成氢键的,吸附力增大。邻位基团间能形成分子内氢键的,吸附力减小。芳香核具有较多共轭键时,吸附力增大。（4）大孔吸附树脂大孔吸附树脂是一种不含交换基团，具有大孔网状结构的高分子吸附剂。粒度多为20-60目。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。大孔树脂可分为非极性和中等极性两类，在水溶液中吸附力较强且有良好的吸附选择性，而在有机溶剂中吸附能力较弱。大孔吸附树脂主要用于水溶性化合物的分离纯化，近年来多用于皂苷及其它苷类化合物与水溶性杂质的分离。也可间接用于水溶液的浓缩，从水溶液中吸附有效成分。硅胶含水量（%）氧化铝含水量（%）活度级别051525380361015ⅠⅡⅢⅣⅤ表10-1硅胶、氧化铝的含水量与活度级别的关系2.吸附剂的活性：氧化铝、硅胶的吸附力的大小,还与其含水量有较大的关系：注意:吸附剂的吸附活性(能力)与活度级别的相反关系活度级数含水量活性吸附能力小少大强大多小弱

所以，加热除水，活性提高，吸附力加强。加一定水，活性下降，吸附力减弱。

活化：105～110℃加热除水为活化。脱活：加一定水份，降低活性。三、色谱条件的选择由于吸附剂的种类有限，因此，当被分离物质、吸附剂种类一定时，分离成败的关键取决于流动相的选择

流动相又称洗脱剂、展开剂或移动相。要求:1.纯度高2.稳定(对样品和吸附剂不反应)3.对样品溶解度大4.粘度小(易洗脱)。1.被分离物质的极性被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢!常见的化合物极性大小顺序:

烷烃<烯烃<醚类<硝基化合物<二甲胺<脂类<酮类

<醛类<硫醇<胺类<酰胺<醇类<酚类<羧酸类被分离物质的极性与结构的关系(1)基本母核相同,基团极性愈大,分子极性愈大。基本母核相同,极性基团数目愈多,分子极性愈大。

(2)分子双键多,吸附力↑,共轭度↑,吸附性↑

。(3)空间排列,影响极性。

如：2.吸附剂的活性:

吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强

被分离物质的极性吸附剂活性大应选→小防吸附太牢,难洗脱小应选→大防tR太小,不易分离

3.流动相:流动相极性↑大，对被测组分的洗脱能力↑大常用流动相极性强弱顺序:石油醚<环己烷<四氯化碳<苯<甲苯几<乙醚<氯仿<醋酸乙酯<正丁醇<丙醇<乙醇、甲醇<水

被分离物质的极性吸附剂活性流动相极性

大小大小大小

以上三方面只是一般性原则,至于使用哪种,要由实验来摸索。流动相选择灵活性很大,往往可用一元,配两元或三元

。也可采用梯度洗脱等技术。图10-3

化合物极性\吸附剂活度和洗脱剂极性间的关系四、操作方法

1．色谱柱的制备

内径与柱长的比例，一般在1:10～20之间.

颗粒大小一般应在100~200目

样品重量:氧化铝重量=1:20~50，对于难分离化合物，氧化铝用量可增加至100~200倍；

硅胶作固定相其比例一般为1:30~60，如为难分离化合物，可高达1:500~1000。(1)玻璃柱干法装柱湿法装柱

（2）尼龙柱2．加样与洗脱

加样的方法有三种：①试样配成浓溶液，用吸管轻轻沿管壁加入柱内，然后加流动相洗脱。②③用一块比色谱柱内径略小的圆形滤纸吸附试样溶液，待溶剂挥发后，加入柱内，然后加流动相洗脱。洗脱时,应连续不断地加入洗脱剂，切勿断流。

并调节一定的流速。3．检出可以通过分段收集流出液，采用相应的物理和化学方法进行检出。对有色混合物，很容易观察化合物的分离情况，对无色物质，可用紫外光观察荧光色带而检出。也可用荧光吸附剂，通过荧光熄灭定位。

第2节液～液分配柱色谱法（LLC）1940年英国人Maritin(马丁),Sngger(辛格)分配色谱获诺贝尔奖金。1952年两人再度合作,发明气相色谱。经典的液—液分配色谱(liquidliquidpartitionchromatography，LLC)是将某种溶剂（固定液）涂布在多孔微粒的表面或纸纤维上，形成一层液膜，构成固定相。多孔微粒或纸纤维称为支持剂(solidsupport)或载体(carrier)、担体。一、基本原理:

有些强极性化合物,能被吸附剂强烈吸附,即使使用洗脱能力很强的流动相也难推动,从而使吸附色谱无法分离。为克服之，发明了液—液色谱。利用混合物中各组分在两相中溶解度不同而达到分离。

K=Cs/Cm二、载体载体(担体):惰性物质,要有较大的表面积(起负载固定液的作用)。有硅胶、纤潍素、硅藻土等三、固定液及其选择正相分配色谱，其固定相的极性大于流动相，即以强极性溶剂作为固定液，以弱极性的有机溶剂作为流动相；

反相分配色谱，其固定液具有较小的极性，而流动相则极性较大。正相反相固定相极性大小流动相极性小大适于分离的物质极性物质中等极性至非极性的物质流出顺序极性小的组分先流出柱极性大的组分先流出正相色谱与反相色谱的比较在正相分配色谱法中，固定液有水、各种缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、甲酰胺或丙二醇等强极性溶剂，以及它们的混合液.在反相分配色谱中，常以硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶剂作为固定液，而以水、水溶液或与水混溶的有机溶剂为流动相。四、流动相及其选择一般正相色谱法常用的流动相有石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷类、苯等或它们的混合物。

反相色谱法常用的流动相则为正相色谱法中的固定液如水、各种水溶液(包括酸、碱、盐及缓冲液)或低级醇类等。注意点：流动相在使用之前，必须先用固定相饱和,以防固定相流失五、操作方法

1．固定液的涂布与装柱装柱前，首先将固定液与载体混合。如果用硅胶、纤维素等作载体时，可直接称出一定量的载体，再加入一定比例的固定液，混匀后即可装柱。

2．加样和洗脱第3节.离子交换色谱固定相:离子交换树脂流动相:水溶液或缓冲液分离机制:差速迁移分离对象:离子化合物(一)树脂分类:具有网状立体结构的高分子聚合物。

联上酸性基团：阳离子交换树脂（-SO3H,-COOH等）联上碱性基团：阴离子交换树脂（-NH2,-NHR等）阳离子交换反应：(树脂可反复使用,用HCL浸泡,冲洗)阴离子交换反应：

(阴离子树脂的再生,用适当的碱液浸泡)nRSO3H+Mn+交换洗脱(RSO3)nM+nH+用NaOH滴定H+，由耗V求X%(树脂再生)N(CH3)3+OH

-R+Cl

-交换洗脱N(CH3)3+Cl

-R+OH

-用酸液滴定可求X%H+(二)树脂的性能:

1.交联度:交换树脂中,交联剂(二乙烯苯)的含量为交联度,以重量百分比表示。

交联度网眼交换体积大的离子大小慢不易进入小大快大小离子均可进入阳离子交换树脂一般交联度8%(常用)阴离子交换树脂一般交联度4%2.交换容量:

每克树脂能参加交换反应的活性基团数。单位:mmol/g;mmol/ml3.粒度:以溶涨态所能通过筛孔来表示。10～50目—交换水用;100～200目—分析用。(三)离子交换平衡常数:

1.[A+]r、[B+]r分别表示树脂中A、B离子的浓度;[A+]、[B+]分别表示水液中A、B离子的浓度;若

KB/A>1,说明B+较牢地结合在树脂上

KB/A<1,说明A+较牢地结合在树脂上所以KB/A说明了树脂对A+、

B+两种离子选择性交换的能力,故也称之为选择性系数。KB/A

↑,B与树脂结合能力强,洗脱慢,tR

↑。2.选择性系数与分配系数的关系:

即:分配系数不同是离子交换分离的先决条件。

要求：固定相→离子交换树脂流动相→水为溶剂的缓冲溶液被分离组分→离子型的有机物或无机物分离机制见图示分离机制：

依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离第4节空间排阻柱色谱法（SEC）

空间排阻色谱(stericexclusionchromatography，SEC)是20世纪60年代发展起来的一种色谱分离方法，又称为：凝胶色谱法(gelchromatography)

分子排阻色谱法(molecularexclusionchromatography)分子筛色谱法(molecularsievechromatography)尺寸排阻色谱法(sizeexclusionchmmatography)。该色谱法根据流动相的不同又可分为两类：以有机溶剂为流动相者，称为凝胶渗透色谱法(gelpermeationchromatography，GPC)；以水溶液为流动相者，称为凝胶过滤色谱法(gelfiltrationchromatography，GFC)。主要用于大分子物质如蛋白质、多糖等的分离。一、基本原理

以凝胶（有机高分子的多孔聚合物）作为固定相，有机溶剂或水溶液作为流动相，利用样品中不同组分的分子尺寸的差异以实现混合物的分离。分离机制：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离.要求：固定相→多孔性凝胶流动相→水——凝胶过滤色谱流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱分离机制见图示渗透系数

注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，与流动相的性质无关第5节薄层色谱法TLC

操作流程:铺板—活化—点样—饱和—展开—显色—定性,定量。

一.基本原理:

1.分离过程

将混合组分的试液,点在铺了吸附剂的玻璃板一端,在密闭容器中用适当的溶剂(展开剂、流动相)展开,各组分不断地被吸附,解吸附…随展开剂前移,利用吸附剂对不同组分的吸附力(吸附常数)不同,产生差速迁移,而达到分离。特点:快速、灵敏(几～几十微克)、高选择、显色方便。

RfA=a/cRfB=b/c2.比移值

比移值当固定相、流动相一定时，Rf与与组分性质K的关系如下：色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为Rf=0未移行(被固定完全吸附,K

)Rf=1移至前沿(组分不被固定相吸附,K

0)

一般:0＜Rf＜1

1）固定相、流动相一定时，Rf值与物质极性的关系是：物质的极性↑大，K↑大，吸附得越牢，移动距离越小，Rf↓小物质的极性↓小，K↓小，吸附得越弱，移动距离越大，Rf↑大

2）固定相、组分的极性一定时，Rf值与展开剂极性的关系是：展开剂极性↑大，Rf↑大（容易洗脱）展开剂极性↓小，Rf↓小（不容易洗脱）

3）展开剂、组分的极性一定时，Rf值与固定相吸附力的关系是固定相吸附力↑大，Rf↑小固定相吸附力↓小，Rf↑大

Rf最佳范围:0.3～0.5,也可控制在0.2～0.8范围内。

3．相对比移值某物质，当色谱条件一致时，Rf定值，定性用，但重现性差。有人建议用相对比移值定性。

参考斑点可以是另加的物质,亦可以样品中另一组分为参考。4.分离度分离度（R）的计算公式为：d2为第2个色谱斑点的中心与原点的间距d1为第1个色谱斑点的中心与原点的间距W1及W2为相邻两斑点的直径一般分离度应大于1.0。123456溶剂前沿T=23℃RH=62%图1延胡索薄层色谱鉴别（365nm紫外光灯检视）1.妇科养坤丸(EEC002)2.妇科养坤丸(EEC001)3.妇科养坤丸(E05005)

4.延胡索对照药材5.延胡索乙素对照品6.延胡索阴性对照图一：硅胶HPTLC分离金光菊属植物（紫锥花类）根部提取物，从左到右分别为：海胆苷、咖啡酰酒石酸、紫锥菊、紫锥菊－蒲草（75％:25％）、紫锥菊－蒲草（50％:50％）、紫锥菊－蒲草（25％:75％）、蒲草、洋蓟酸、菊聚酸。二.固定相

1.吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用,但薄层色谱所用的硅胶、Al2O3粒度比柱色谱更细。硅胶40

m(一般要求200目左右)

符号:硅胶G硅胶+石膏硅胶H硅胶(未加任何物质)硅胶HF254

硅胶不含粘合剂+荧光物质硅胶GF254

硅胶+石膏+荧光物质

荧光剂：①Mn激活的ZnSiO4（F254），在紫外光（254nm）灯下呈淡绿色荧光②Ag激活ZnS、CuS（F365），呈绿色荧光三.展开剂选择:(同柱)仅操作方法不同。分离强极性物质,选择强极性展开剂,同时也应考虑固定相的活性。

物质极性吸附力流动相极性防止大强大太牢,Rf太小小弱小Rf太大分离混合样品时,展开剂选择一般规则:(1)先用单一的中等极性展开剂试一下。(2)改用二元展开剂,其比例要摸索。目的:改变展开剂的极性。图10-6点滴试验法例:

A、B两组分试样AB展开剂苯Rf0.450.42分不开改为苯+乙醇Rf0.520.46可分开能否说出A、B哪一组分极性大？解：显然B的极性大。因为展开剂极性加大时,极性大的组分Rf↑(相似相溶)。

此外，为提高分离度、防止斑点拖尾，通常：①分离酸性成分，使用酸性展开剂。②分离碱性物质，使用碱性展开剂。四、操作方法

1.薄层（硬）板的制备

(1)载板的准备多用玻璃板作为载板，也可用塑料膜和金属铝箔，要求表面光滑,平整清洁，以便吸附剂能均匀地涂铺于上。常用规格有10cm×10cm、10cm×20cm、20cm×20cm等。(2)薄层(硬)板的铺制

粘合剂煅石膏：吸附剂的9-15%左右羧甲基纤维素钠CMC-Na：0.5-1%水溶液合成有机物：聚乙烯醇2.5%（有时对显色剂无效）铺板方法手工铺板与机械铺板各种吸附剂铺板方法⑴硅胶G⑵硅胶H⑶氧化铝G（含9%煅石膏）2.点样点样体积：一般在1～10

l,

点样量太大,斑点易拖尾点样方式：接触式点样与喷雾式点样原点形状：点状、条状点样器具：微量进样器、定量毛细管；底距：1.5～2cm点距：0.8～1.5cm原点直径

：

2～3mm。（边点边热风吹）接触式点样应注意：

正确选择溶解样品的溶剂,防止点样环形色谱效应原点直径一般以3mm为宜

防止点样毛细管损伤薄层表面

尽量避免多次点样

点样环形色谱效应：在点样的同时，样品在原点呈环状展开，如果样品在溶剂中的溶解度很大，原点将变成空心环，称为“点样环形色谱效应”。克服方法:应选择样品组分溶解度相对较小的溶剂以避免此现象的产生。喷雾式点样点样仪（Linomat5半自动点样仪）喷雾点样的优点：点样过程中，点样器不与薄层板接触，可防止薄层板表面物理损伤。

能减少样品横向、纵向扩散，样品斑点窄，展开后分离度提高。

自动化程度高，样品溶液不易在针壁上残留，可提高点样的准确度与重现性。3.展开

将点好样的薄层板浸入展开剂中，展开剂借薄层板上固定相的毛细作用携带样品组分在薄层板上迁移一定距离的过程称为展开，见图10-9。（1）展开装置常用的展开装置有直立型的单槽色谱缸和双槽色谱缸（常用其规格有10cm×10cm、10cm×20cm、20cm×20cm等）、圆形色谱缸、卧式色谱缸等。(2)展开方式

一般展开方式：上行、斜行与下行展开距离：6～15cm注意点：①薄层板浸入展开剂中的深度约0.5cm,不能浸住起始线,层析缸应密闭。②先饱和15～30分钟,再展开,防止边缘效应。

边缘效应是指同一物质的色谱斑点在同一薄层板上出现的两边缘部分的Rf值大于中间部分的Rf值的现象。产生该现象的主要原因是由于色谱缸内溶剂蒸气未达饱和，造成展开剂的蒸发速率在薄层板两边与中间部分不等。展开剂中极性较弱和沸点较低的溶剂在边缘挥发的快些，致使边缘部分的展开剂中极性溶剂比例增大，故Rf值相对变大。a）TLC第一次展开、b）TLC第二次展开、①单向多次展开用同一种展开剂，沿同一展开方向展开多次。通过增加展开距离,达到更好的分离效果特殊展开方式：不同展开距离对结果的影响，硅胶HPTLC分离洋甘菊油，

a）3cm

b）5cm

c）7cm

d）9cm。abcd原点12双向展开③双向展开第一次展开后，取出，挥去溶剂，将薄层板旋转90o角后，再改用另一种展开剂展开。见图10-11。②单向多级展开用不同的展开剂，沿同一展开方向展开多次。以达到更好的分离效果。

④离心展开——薄层板以适当转速旋转时，流动相以适当速率转移到薄层上。该技术主要用于制备色谱。薄层色谱展开时相对湿度的影响不同相对湿度色谱结果显示，苍术在较高湿度条件下分离效果较好。薄层色谱展开时温度的影响耐用性试验（Robustness）薄层色谱法变动因素：不同厂牌的薄层板。不同点样方式。展开温度及相对湿度的变化等。系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。目的为用于常规检验提供依据。4.检视

1、有色化合物——直接定位2、无色化合物有紫外吸收UV光斑点有荧光荧光板上有暗斑(显色剂定位)喷雾或浸渍显色蒸气显色：碘-生物碱、氨基酸衍生物、肽类、脂类及皂苷喷雾或浸渍后加热显色显色剂：通用有碘、硫酸不仅有紫外吸收且能产生荧光只有紫外吸收不能产生荧光无紫外吸收(物理定位)五.定性

定性分析方法:将待定性组分与对照品点在同一薄层板上，比较组分与对照品色谱斑点颜色与Rf值的一致性。

对未知样品,要几个展开体系均有一致Rf值,才可认为同一物质。

样对123456溶剂前沿T=23℃RH=62%图1延胡索薄层色谱鉴别（365nm紫外光灯检视）1.妇科养坤丸(EEC002)2.妇科养坤丸(EEC001)3.妇科养坤丸(E05005)

4.延胡索对照药材5.延胡索乙素对照品6.延胡索阴性对照点样顺序从左至右分别为连续三批供试品、对照药材、对照品、阴性对照六、定量:

（一）

洗脱法:误差

5%(基本符合微量分析误差要求)。薄层分离——取下斑点——洗脱——离心——取上清液进行测定（二）

薄层扫描法:误差<5%(符合要求)。

薄层扫描法又称原位定量薄层扫描法（insituquantitativethinlayerchromatography,QTLC）。本法是将一定波长的单色光垂直照射展开后的薄层板，测定薄层色谱斑点的吸收度随展开距离的变化，所得关系曲线下的面积与色谱斑点中待测物质的浓度或量成正比，这种定量分析方法称为薄层扫描法。1.基本原理Kubelka-Munk理论由于薄层板上的固定相，对光的散射现象，色谱斑点中待测物质的吸收度与浓度的关系不符合比尔定律。Kubelka-Munk理论充分阐明了薄层色谱斑点中待测物质的吸收度与浓度的定量关系。(克曼方程)设薄层板上固定相的厚度为X,入射光的强度为I0，当透过厚度x的固定相后，照射在微分薄层厚度dx上的入射光强与反射光强分别为i和j时，见图10-12。其入射光强的增量与反射光强的增量分别符合下面两个微分方程（10-9）

（10-10）

式中S为薄层单位厚度的散射系数，K为薄层固定相单位厚度的吸光系数.K值与薄层色谱斑点中待测物质的浓度成正比。K虽称为“吸光系数”，仅因“单位厚度”而得名。将式（10-9）与式（10-10）联立求解，可得透过x薄层厚度固定相后的透过光强i及反射光强j与色谱斑点中物质的浓度或量之间的关系（体现在参数a及b中的K）。

（10-11）

（10-12）式中，，

A和B均为常数。在薄层扫描时，我们通常只考虑薄层板的上表面（x=X）反射光的强度j及薄层板的下表面（x=0）透过光的强度i与色谱斑点中的待测物质的浓度或量的关系。图10-12散射性薄层截面示意图I0—照射强度；

i(x)-x处的透射光强；j(x)-x处的反射光强；x—固定相层厚（1）薄层色谱斑点的反射率在薄层板的上表面，即

x=X处，I=I0，j=I0R。则

（10-13）式中SX为薄层板的散射参数，它与固定相的种类、粒度及涂布均匀程度有关，其值的大小直接影响到偏离比尔定律的程度。KX为吸收参数，相当于薄层色谱斑点单位面积中待测物质的量()。

当SX一定时(如Merck厂生产的硅胶板SX=3，氧化铝板SX=7)，R与色谱斑点中待测物质的量（KX）符合上式。（2）薄层色谱斑点的透光率T

在薄层板的下表面，即x=0处，I=I0T，j=0。则

（10-14）

同理，当SX一定时，T与色谱斑点中待测物质的量（KX）符合上式。（3）薄层色谱斑点的吸光度A

理想的空白薄层板的单位薄层厚度的吸光系数K=0。事实上，一般空白板K≠0。为了消除此影响，通常在薄层扫描中都是以空白板为基准，测定相对透光率及相对反射率来计算薄层色谱斑点的吸光度。在透射法中薄层色谱斑点的吸光度为

在反射法中薄层色谱斑点的吸