第十章 色谱技术

第十章色谱技术目录第一节色谱技术概述第二节吸附色谱第三节基于疏水作用的高效液相色谱第四节体积排阻色谱第五节亲和色谱第六节离子交换色谱色谱基本理论、基本概念；生物药品的常用吸附色谱、反相色谱、离子交换色谱以及亲和色谱技术各种色谱技术中常用的色谱固定相各类色谱技术的应用领域针对目标药物体系，熟练选择合适的色谱技术对目标药物进行分离纯化。学习目标掌握熟悉了解能力要求第一节色谱技术概述色谱(Chromatography)技术又被称为层析技术。一、色谱法分类固定相基质的形式分离原理

流动相的形式

纸色谱薄层色谱柱色谱吸附色谱分配色谱体积排阻色谱离子交换色谱亲和色谱

气相色谱液相色谱超临界流体色谱

（一）概述液相色谱主要通过目标组分或待分离物在两相间分配能力或作用力不同而使目标组分得以分离，其中一相保持不动，称为固定相，而另一相移动，被称为流动相。待分离组分，通过在固定相以及流动相之间各种作用力的矢量和差异而得到分离，这些作用有色散力、氢键、离子键、亲水作用、疏水作用、静电相互作用、分子扩散、亲和、络合、共价键修饰或交换等。二、基本概念加样和流动相入口洗脱液收集并检测进样阀检测器输液泵贮液瓶进样流出液色谱柱（二）固定相也称为柱填料，是液相色谱的核心部件。固定相的骨架材料又称为色谱基质利用化学或其他方法将相应特性的分子键合至色谱基质表面，构成键合固定相，也称为键合相色谱填料。

多孔硅胶

可控孔径玻璃

羟基磷灰石氧化铝、氧化锆无机材料有机高分子1.色谱基质

聚苯乙烯-二乙烯苯

聚甲基丙烯酸酯

纤维素葡聚糖及其修饰产物

2.粒径和结构LC应用粒径（

m）分析型3～10制备型10～40低压/大规模制备型40～150极大规模制备型150～300中孔填料大孔填料微孔填料

3.填料孔径色谱基质的孔径一般必须是待纯化的溶质分子大小的5倍以有利于它们通过分子扩散进入所有的孔。1000到10000Å180~500Å60~120Å

4.键合相：是共价键合或通过吸附、涂敷等附着于色谱基质表面上的提供与流动相中溶质分子产生相互作用的分子。

三、色谱效率（一）基本保留原理信号强度tRBtRA半峰宽WAh/2WBh/2WAWB基线峰宽to峰高（h）AB0（样品注射点）VoVRAVRB（死体积）洗脱体积/时间保留因子或容量因子：k

=(tR-to)/to=(VR-Vo)/Vok

越大，则表明该溶质在特定条件下与固定相的作用力越强，对应于保留时间来说，其保留时间较长；反之，则保留时间较短。选择因子：

=kB

/kA

选择因子

越大，则表明A和B两种成分于特定条件下在该柱子上越容易被分离开来。柱效：N=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2柱子效率越高表明特定条件下固定相对某溶质的分离效果越好。分辨率：Rs=(tRB-tRA)/(WA+WB)1/2=(tRB-tRA)(WAh/2+WBh/2)0.85=(1/4)(

-1)(N1/2)(k

/1+k

)Rs值越大，两种组分分离的越好。Rs=1，两组分具有较好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。ab峰不对称因子=b/a10%峰高信号强度洗脱体积/时间峰不对称因子（As），主要是反映固定相与组分之间的作用力强弱情况，如果As越大，则表明组分与固定相在特定洗脱条件下相互作用力越大，产生拖尾现象。（二）柱效柱效：N=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2依据塔板理论，塔板数越高，表明溶质分子在柱子上的分离效率越高。N已知，柱效可通过柱子的长度（L）与理论塔板高度（H）之间的比值进行计算，即N=L/H。小粒径色谱填料、低流动相流速和不太粘稠的流动相有利于减小H值。H值小，则N大，此时W也小。（三）样品负载量样品负载量也称柱容量，是指可以注入色谱系统而又不会使柱过载的最大可进样品量，通常以每克柱填料对应的的最大进样量来表示。它显示了柱的大小和其对应的样品处理能力，对于分析性色谱来说，样品负载量决定了动态的分析范围。两种计算方法：（1）以非装柱的形式，通过样品与对应数量的柱填料之间的平衡，确定最大样品负载量；（2）以装柱的形式，在柱色谱中，当进样量达到柱子的饱和负载量时，洗脱液中样品的浓度等于注入样品的浓度。第二节吸附色谱吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程，被吸附的物质称为吸附质。四个步骤：（1）吸附剂通入待分离的料液（或气体）；（2）吸附质被吸附到吸附剂表面（3）料液流出（4）吸附质解吸回收，吸附剂再生。一、吸附类型（一）物理吸附——分子间引力（范德华力）特点：（1）无选择性（2）吸附量可由物系不同相差较大（3）低温可进行（4）单、多分子层吸附均可（5）易达到吸附平衡状态

一、吸附类型（二）化学吸附——化学键特点：（1）较高温进行（2）放热（3）单分子吸附（4）不易和解析，平衡慢

（5）选择性强

一、吸附类型（三）交换吸附——双电层特点：（1）吸附剂和溶液发生离子交换（2）吸附力决定于离子所带电荷二、常用吸附剂吸附剂具备特性：（1）对被分离的物质具有很强的吸附能力，即平衡吸附量大；（2）有较高的吸附选择性；（3）有一定的机械强度，再生容易；（4）性能稳定、价廉易得。（一）、活性炭活性炭按照粒径大小可分为粉末活性炭、颗粒活性炭以及基于粉末活性炭制备的颗粒型活性炭。

（二）、大孔网状聚合物吸附剂性质与活性炭、硅胶相似，简称大网格吸附剂、大孔树脂吸附剂或吸附树脂。（1）脱色去臭力与活性炭相当，对有机物质具有良好的选择性（2）性质稳定，机械强度好，经久耐用，品种多（3）吸附速度快，易解吸，易再生，直径在0.2~0.8mm之间，不污染环境，使用方便（4）价格昂贵，吸附效果易受流速和溶质浓度等因素影响1.大孔网状聚合物吸附剂类型和结构名称树脂结构极性比表面孔径孔度骨架密度交联剂XAD-1苯乙烯非极性100200371.07二乙烯苯XAD-233090421.07XAD-35264438XAD-475050511.08XAD-54156843XAD-6丙烯酸酯中极性6349849双

-甲基丙烯酸二乙醇酯XAD-7

-甲基丙烯酸酯45080551.24XAD-8

-甲基丙烯酸酯140250521.25XAD-9亚砜极性25080451.26XAD-10丙烯酰胺极性69352XAD-11氧化氮类强极性170210411.18XAD-12氧化氮类强极性251300451.172.大孔网状聚合物吸附剂吸附机制大孔网状聚合物吸附能力与树脂的化学结构、物理性能、溶质及溶液的性质有关。非极性吸附剂适宜于从极性溶剂（如水）中吸附非极性物质。高极性吸附剂适宜于从非极性溶剂中吸附极性物质。中等极性的吸附剂两种者均可吸附，在非极性溶剂中吸附时，溶质分子以亲水性部分吸着在吸附剂上，而当它在极性溶媒中可同时吸附溶质分子的极性和非极性部分。解析方法32411143低级醇、酮或其水溶液

碱解析弱酸性溶质酸解析弱碱性溶质水洗其他因素：无机盐、孔径比表面积极性颗粒度孔径吸附容量大、吸附速度快、机械强度好

三、影响吸附的因素（一）吸附剂的性质固体表面张力越小，液体被吸附越多溶质从较易溶解的溶剂中被吸附时，吸附量较小同系列物质，吸附量的变化有规律

极性相似，相吸附预测相对吸附量（二）吸附质的性质脱色和除热原一般用活性炭，去过敏物质常用白陶土。（三）温度放热。一旦达到吸附平衡，↑温度会使吸附量↓。但低温时，↑温度↑吸附速度↑吸附量吸热。在这种情况下，↑温度↑吸附量考虑热稳定性。酶热不稳定，0℃左右吸附；比较稳定，室温操作

普通吸附蛋白质吸附生化物质吸附影响吸附的因素盐的浓度溶液pH吸附物浓度与吸附剂用量实验确定

等电点附近吸附量最大。有机酸在酸性下，胺类在碱性下较易为非极性吸附剂所吸附。吸附质平衡浓度愈大，吸附量愈大；蛋白质、酶分离时，浓度﹤1%，以增强选择性；吸附剂用量第三节基于疏水作用的高效液相色谱以疏水作用为基础的液相色谱分离技术主要是反相高效色谱（RP-HPLC）和疏水相互作用色谱（HIC）。一、反相高效液相色谱（一）概述

RP-HPLC是指固定相具有疏水性功能团构成的表面，在高效分离模式中，流动相的极性一般比固定相强，因此称之为反相高效液相色谱。

应用：分析、分离、脱盐特点：高分辨率、联用填料：修饰硅胶、高分子一、反相高效液相色谱（二）流动相的选择

1.反相色谱：流动相极性大于固定相极性的色谱模式。常用流动相：甲醇、乙腈等0～100%水溶液。根据需要可使用pH2～pH8的缓冲液、离子对试剂如0.1%的三氟乙酸流动相选择：相似相溶；溶质分子疏水性强，增加有机相的比例，更换洗脱能力更强的洗脱剂。洗脱能力强弱一般为四氢呋喃>乙腈>甲醇

一、反相高效液相色谱（二）流动相的选择

2.正相色谱固定相：未经修饰的硅胶、氧化铝、二氧化锆等，也可以是经过表面修饰后的色谱填料。采用相对较强的洗脱剂。在正相色谱模式中，一般很少使用含水溶剂，在个别情况下，如以硅胶作为固定相时，水可以极微量的形式存在用于饱和硅胶表面上的活性较强的硅羟基位点。正相色谱流动相可以是石油醚、环己烷、苯、甲苯、乙醇等。二、疏水相互作用色谱HIC主要应用于蛋白质或多肽类的分离中。HIC是一种基于蛋白质和固定相非极性区域相互作用的分离过程，HIC是IEC（离子交换色谱）和SEC（体积排阻色谱）的补充，联用RP-HPLC可进行进一步分离纯化和脱盐。HIC分离蛋白质通常是在中性条件下以线性递减的盐梯度进行洗脱。起始缓冲的盐浓度典型的是在1.5~2.0M硫酸铵，随着盐浓度的减小，吸附不强的蛋白质首先被洗脱下来。HIC可以保持蛋白质或多肽的生物活性而又可有效对其进行分离HIC所选用的基质材料通常为硅胶、聚甲基丙烯酸酯、琼脂糖以及其他相关高分子，粒径可以在5～200

m范围内选择。第四节体积排阻色谱体积排阻色谱（SEC）是将分子按照其大小进行分离的色谱技术，根据固定相和使用环境的不同主要有两种类型，凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。特点柱负载量可通过固定相的量来控制，利于制备分离。严格按分子流体力学体积进行分离大分子可以测定其分子量和分子量分布固定相惰性，无需梯度洗脱；柱寿命较长；固定相生物相容性好，生物大分子活性回收率高分辨率较低，只适用于分子大小差别较大的体系，其峰容量也较低

一、分离机制SEC过程是利用固定相的孔径分布，使分子按照其流体力学体积在固定相的孔及流动相之间不断进行分配而最终分离的。溶剂分子由于相对于固定相的孔径来说通常是非常小的，可以自由出入固定相内各种孔径的孔，而溶质分子一般仅扩散至孔径比自己大的孔中，大于固定相最大可允许进入其孔的大分子，一般只是在构成色谱柱的颗粒之间进行分配。二、凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱是在水相淋洗体系中，对于水溶性大分子化合物按其分子尺寸大小进行分离的一种液相色谱技术。应用：水溶性物质尤其是高分子量水溶性化合物的分离。在溶质分子量相差较大的情况下，GFC方法是目前最简便的一种分离手段，GFC可用于初级分离、缓冲液交换、有机溶剂纯化，用于高分辨和高效快速分离以及分子量的测定等

（一）多糖型GFC填料产品分离范围（球蛋白）粒径/

m耐压/MPa最高流速/cm/h应用特性Superdex75prepgrade3000~7000022~440.390重组蛋白、细胞色素Superose6prepgrade5000~5×10622~400.440肽类蛋白、多糖、寡核苷酸、病毒SephacylS-200HR5000~25000025~750.260白蛋白、血液抗体、单抗SephacylS-1000HR葡聚糖5×105~1×10840~1050.1300巨大多糖分子；小颗粒分子如膜结合囊(<300~400nm直径)或病毒Sephrose6FastFlow10000~4×10645~1650.1250巨大分子如质粒DNA、病毒等SephroseCL-6B10000~4×10645~650.0230蛋白、肽类、多糖（二）高聚物型GFC填料名称基质材料粒度/

m排阻极限或分离范围IonpakS-801磺化PS-DVB1000(多糖)IonpakS-806磺化PS-DVB5×107(多糖)OhpakQ-801聚乙烯醇700(PEG),1800(多糖)OhpakQ-806GMA共聚物1×107(PEG),2.5×107(多糖)Toyopearl系列聚乙烯醇分不同等级7×103~1×107(多糖)TSK-GELDNA-PW亲水性高聚物104×104~8×106(PEG)第五节亲和色谱

亲和色谱（AffinityChromatography，AFC/AC）是基于分子间的各种特异性相互作用（如抗原-抗体、酶-底物、配体-受体、碱基互补等）的色谱模式。亲和色谱基质材料：天然或合成高分子，如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等；无机材料，如可控孔径硅胶（CPS）、可控孔径玻璃（CPG）等。亲和色谱的洗脱剂:一定pH和离子强度的各类缓冲液。动态洗脱、静态洗脱均可。一、亲和色谱基质（一）多糖基质的AFC填料常用的亲和载体：多糖型凝胶，如Sepharose4B与6B、Sepharose4FF与6FF、SepharoseCL-4B与CL-6B多糖表面活性基团（如氨基、羧基以及羟基等）可提供亲和配基的修饰或键合。配体有ProteinA、Heparin、streptavidin、ConA以及LentilLectin等。多糖类可与无机基质形成杂合材料、或者涂敷于无机基质的表面用于改善无机基质材料的生物相容性不好及非特异性吸附问题，用于高效亲和色谱模式。（二）以高聚物为基质的AFC填料常见基质：交联聚苯乙烯、交联聚甲基丙烯酸酯类、亲水性的羟基聚醚、交联聚乙烯醇特点:粒度均匀、孔径较大、刚性良好，pH值适应性广泛，但亲水性和生物相容性不及多糖基质。（三）无机材料为基质的亲和色谱填料基质材料：多孔硅胶，可控孔径玻璃（CPG）硅胶孔径：30~100nm小粒径无孔硅胶（粒子直径小于3

m）由于传质阻力小，也被用于AFC填料。二、固定化金属离子亲和色谱亲和色谱中必须考虑以下两个重要因素：（1）选择的基质本身应能够经受住柱再生时所使用的剧烈条件，如使用NaOH或脲等；（2）选择的配基与目标分子具有很强的结合作用以便使其能从复杂的基体中抓住目标分子。固定化金属离子亲和色谱（ImmobilizedMetal-ionAffinityChromatography,IMAC）是基于组氨酸、半胱氨酸和色氨酸侧链可以与固定于色谱基质（通过亚氨基二乙酸（IDA）固定）上的过度金属离子（如Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+等）相互作用。分布于蛋白质表面的这类氨基酸残基的多少决定了蛋白质或多肽与金属离子亲和固定相之间的相互作用强弱，因此很少蛋白质会强烈地结合在固定化金属离子亲和固定相上，这有利于蛋白质的分离纯化。蛋白质解吸可于洗脱液中添加竞争配基如咪唑、组氨酸、氯化铵、组胺或甘氨酸通过逐步洗脱或梯度洗脱的方式进行。蛋白质吸附条件：pH（7.0~8.5），缓冲液内加入0.1~1MNaCl可减少非特异性的静电相互作用。在IMAC中常用磷酸盐、Tris、硼酸盐、HEPES以及乙酸缓冲液，典型浓度是20~100mM。很多添加剂不影响IMAC过程，但一些离子型表面活性剂、叠氮化钠和螯合试剂通常对IMAC有毒害效应。凝集素亲和色谱(LectinAffinityChromatography)凝集素是一种糖结合蛋白，可特异性地与糖基偶合物相互作用。凝集素亲和柱特别适合于纯化膜蛋白和分泌蛋白，因为这些蛋白常常是糖基化的。在柱中，非糖基化的蛋白质首先被洗脱下来，糖基化蛋白可以在固定相上通过水解得到，非糖基化的多肽可以通过进一步洗脱得到。凝集素亲和色谱可以一批一批的进行，