第10章 遗传重组和转座子

10.遗传重组和转座10.1遗传重组的类型10.2同源重组10.3位点专一性重组10.4异常重组——转座10.遗传重组和转座概述：◘只要有DNA，就会发生重组减数分裂高等真核体细胞核基因、叶绿体和线粒体温和噬菌体转座子转座◘生存→变异(突变+重组)→损伤修复→适应环境→加速进化◘广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程◘狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流过程

重组类型

DNA序列

蛋白因子/酶同源重组

需长同源

重组酶（Rec

ABCD）

普遍重组位点特异重组

需短同源

位点专一性蛋白

整合重组

整合酶，切离酶异常重组/转座

不需

转座酶

复制性重组狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流遗传重组与重组DNA技术同源重组的特征：涉及同源序列间的联会，且交换的片段较大；涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂-错接的过程——异源双链区的生成；存在重组热点；需要重组酶；单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号10.2同源重组（homologousrecombination）细线期合线期粗线期双线期终变期◘e.g.

真核细胞减数分裂时染色单体间交换；

细菌的转化、转导、接合；病毒/噬菌体重组（单向重组）Mitchell：+pdxpxpdx+

孢子对子囊1234（1）+

pdxppdx++

+pdx

+（2）+

+pdx++

pdxp+

pdxp（3）+pdxp+

+pdx

++

+（4）pdx

++pdxppdx

+pdx

+脉孢霉pdxp：酸度敏感的VB6依赖型

pdx：酸度不敏感的VB6依赖型10.2.1

基因转变

1930年,Ｈ.Winkler把不规则分离的现象解释为减数分裂过程中同源染色体联会时一个基因转变为其等位基因——基因转变（geneconversion)

。AAAAaaaa粪生粪壳菌(Olive):

G

A×g

a

GA非重组孢子对GagaGAgAga非重组孢子对重组孢子对，一个孢子基因转变重组孢子对，一个孢子基因转变6:2/2:6，5:3/3:5，3:1:1:3

的异常分离比，＜10E-3

Aa以后又发现一个基因发生转变时它两旁的基因（侧翼标记）常同时发生重组，所以认为基因转变是某种形式的染色体重组的结果。例如Ag+×ag-的杂交（Ａａ是一对关于接合型的基因）:g+和g-可以发生转变，而且凡是g+或g-发生转变都伴随着Ａ和ｇ之间的重组。由于基因转变常伴随着重组的发生，所以基因转变机制的研究，实质上也是染色体交换机制的研究。（二）基因转变的类型染色单体转变：2:6或6:2分离比

减数分裂4个产物中，1个出现基因转变

半染色单体转变：5:3；3:1:1:3

减数分裂4个产物中，1个或2个的一半出现基因转变

减数分裂后分离：等位基因的分离发生在减数分裂后的有丝分裂中（三）基因转变的分子机制A都不校正B仅一链校正C两链同向校正D各自校正

3113

53/35

62/26

44根据切除修复原理，基因转变的几种类型产生的分子机制可以归纳如下（图10-6）。1．两个杂种分子均未校正（图10-6A）复制后出现异常的4＋∶4g（或3∶1∶1∶3）的分离；2．一个杂种分子校正为+，或校正为g时，则发生另一种类型的半染色单体转变，前者修复后出现5∶3的分离，后者子囊孢子的异常分离比为3∶5（图10-6B）；（三）基因转变的分子机制3．两个杂种分子都被校正到+（或g）时（图10-6C），修复后出现6＋∶2g（或2＋∶6g）的异常分离，这便是出现染色单体转变的起因；4．当两个杂种分子都按原来两个亲本的遗传结构进行修复时，则减数分裂4个产物恢复成G-C、G-C、A-T、A-T的正常配对状态，子囊孢子分离正常，呈现4＋∶4g的结果，如图10-6D所示。（三）基因转变的分子机制（三）基因转变的分子机制

基因转变的实质：重组过程中留下的局部异源双链区，在细胞内的修复系统识别下，不同的切除/修复方式产生不同的结果。10.2.2同源重组的分子机制一.交叉理论（chiasmatatypehypothesis） Janssens,1909二.断裂和重接模型(Darlington,1937)三.模板选择学说（copychoice）

BellingJ.首提、1933撤回;Hershey,1948四.Holliday模型(R.Holliday1964)减数分裂中的同源配对-片段互换-基因重组同源染色体配对的结构基础——联会复合体；同源重组——非姐妹单体的片段交换。PrVgPrVgPrVgPrVgPrVg+PrVg+

Pr+Vg+

Pr+VgPr+VgPr+Vg+Pr+Vg+Pr+Vg+减数分裂中”染色体交叉/换=同源重组”

断裂重接模型

不能解释基因转变和极化子现象.

极化子（polaron）:

指同一基因内部的各个突变位点的转变频率常从基因的一端向另一端逐步递减，具有这种现象的一段DNA称为极化子。一个极化子相当于一个基因.模板选择复制模型

①不符合半保留复制;②DNA复制应在S期,重组应在偶线期，不应同时发生。③不能解释3线和4线交换。任何基因重组的模型都必须解释异源双链的形成以及基因转变往往伴随着两侧基因重组这一现象。1964年美国学者RobinHolliday提出了著名的Holliday模型.在Holliday模型中,极化子是由于交换产生的错配只发生在异源双链部分，而此部分只发生在Holliday结构的断裂和分枝点之间，离断裂点越远的基因离分枝点可能也越远，因而不在异源双链的部分。同源重组的Holliday模型RobinHolliday于1964年提出了重组的杂合DNA模型，又称Holliday模型，对重组过程的解释如下：A:同源的非姐妹染色单体联会；B：同源非姐妹染色单体DNA中两条方向相同的单链在DNA内切酶的作用下，在相同位置同时切开；C：切开的单链交换重接;D：形成交联桥结构；同源区-配对/联会-切-换-接-移-转-切-接=重组E：交联桥沿配对DNA分子“移动”。两个亲本DNA分子间造成一大段异源双链DNA（Holliday结构）F：E和F相同；G：绕交联桥旋转1800；J：形成Holliday异构体；I、通过两种方式之一切断DNA单链，若左右切，则形成非重组体，若上下切则形成重组体。由上可知：无论Holliday结构断裂是否导致旁侧遗传标记的重组，他们都含有一个异源双链DNA区。同源区-配对/联会-切-换-接-移-转-切-接=重组Holliday模型(RobinHolliday1964)：同源区-配对/联会-切-换-接-移-转-切-接=重组2、分枝迁移和Holliday结构的拆分◘分枝迁移（branchmigaration）－－双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散Holliday结构的异构化产生重组体的拆分Holliday结构一经生成即可不断地处于异构化－－异源双链

heteroduplexDNA重组结果取决于拆分时配对链上的切口位置Holliday模型中的杂合双链部分必须得到校正。如果在减数分裂后的有丝分裂DNA合成前得到校正，那么将产生正常的４:４分离或６:２分离（染色单体转变）；如果没有及时得到校正而留到下一轮DNA复制而产生两个非杂合的双链，那么将产生５:３或不正常的3:1:1:3分离（半染色单体转变），我们将这种没有及时校正而下一轮ＤＮＡ复制时才被校正的现象称为减数后分离。三、原核同源重组（E.coli）◘发生在双方DNA的同源区域

部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间细菌的转化、接合和转导

1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位点◘具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、

序列特异性的单链内切酶活性◘单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链－－－RecA的作用位点◘RecBCD有固定切割位点3‘◘RecBCD的识别和切割位点a、RecBCD结合在DNA的平头末端（产生机制不清楚）b、外切、解链、移动（ATP）c、兔耳状loop结构产生（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop单链区的

chi位点3‘方4～6NT处切断单链（单链内切酶）☀

chi位点：GCTGGTGG

目前发现的重组热点

E.coli

含1000个、真核e、RecBCD切割产生3’单链末端

2、RecA蛋白

（1）

活性a、RecA有单、双链DNA结合活性b、RecA有NTPase活性（底物差异活性）与单链DNA结合时活性最大---依赖于DNAc、RecA有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子的能力，即联会同源DNA

（但其靶DNA必须有缺口－－结合DNA）RecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模型RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend.

RecA启动的单链入侵RecA引起的链交换和Holliday结构的生成

（2）RecA蛋白催化双链和单链DNA

的反应阶段a、联会前阶段（缓慢）

RecA与单链结合b、单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子

Holliday（5‘侵入）c、从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链DNA

反应结束时，RecA结合到双链上◘其中—单链同化有固定的方向入侵单链为5’－3‘

双链DNA的互补链是3’－5‘◘RecBCD和

RecA的共同作用

3、原核同源重组的其它蛋白

需要E.coli中三个基因ruvA,ruvB和ruvC的产物a、RuvA识别Holliday结构的连接点b、RuvB为分枝迁移提供动力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸内切酶---专一性识别Holliday结构的连接点体外切段连接点以拆分重组体◘E.coli重组的各阶段（损伤修复）损伤DNA复制产生缺口RecA链交换第二次链交换DNApol通过DNA合成填满缺口RuvA,B分枝迁移RuvC切割Holliday连接点细菌的同源重组一、细菌同源重组的特点细菌的接合、转化以及转导重组都是同源重组，而且这种重组是发生在一个完整的环状双螺旋DNA分子与一个双链或单链DNA分子片段之间的。且重组需要RecA和RecBCD蛋白质的参与。

细菌的转化重组细菌的接合与转导中的重组机制接合重组（Hfr与F-之间进行）部分DNA进入细胞，且只有其中的部分参与重组，需要RecA和RecBC参与，机制与转化重组相似;转导重组（phage-DNA与细菌之间）双链DNA与完整双链DNA之间的重组，供体DNA以双链进入受体细胞，并且以双链形式整合进入染色体，需要RecA和RceBC参与。10.3位点专一性重组（

site-specificrecombination）一、位点特异重组（

site-specificrecombination）1、概念：发生在专一序列的DNA分子间的重组（整合重组）噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组2、特征：在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接

----产生精确的DNA重排都具有整合作用的两个基本特征a、典型的保守性重组---交换是相互的且保存原先的DNAb、发生在噬菌体和细菌DNA的短而同源的专一序列上真核

中专一性抗体基因的构建二、λphage的整合与切除1、实现机制：均是通过

细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组2、特定位点-----附着位点（attachmentsiteatt）E.coliattB

含BOB’三序列23bp，位于bio和gal基因之间B,B’,P,P’---臂核心序列“O”完全一致

（同源部分）

---位点特异性重组发生的地方λphage

attP

含POP’三序列

240bp

通过attP和attB间的相互重组，环状的噬菌体DNA转换为整合的原噬菌体，原噬菌体通过attL和attR间的相互重组而切离3、整合过程

λ噬菌体：attP

POP’

大肠杆菌：attB/attλBOB’

1.整合：BOB’+POP’

BOP’+POB’

2.切离：BOP’+POB’

BOB+POPIntIHFInt,XisIHF3、整合过程4、整合分子机制◘核心序列O全长15bp，富含A-T◘发生在O内的重组交换位点相距

7bp◘整合酶的结合位点：attP240bp、attB23bp(两者的作用不同)◘attP位点的负超螺旋为重组所必须---加强了Int和IHF的亲和力

-----高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构◘Int结合

----核心序列的反向位点（切割位置）

----结合在att臂上（臂与核心区靠近）intIHFXis整合体及其作用整合体（intasome）---Int和IHF结合到attP时的复合物整合体捕获attB

说明-----

a、attB和attP的最初识别靠Int

识别两序列的能力

b、两序列的同源性在链交换时为重要因素Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，进而使holliday结构拆分重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交5、整合与切除的控制（1）整合CⅡ---促使阻遏蛋白CⅠ的产生

---与intgene

的PI结合，转录产生Int蛋白

---且PI位于xis基因内，CⅡ与PI结合导致xisgene失活（2）切除寄主SOS反应时---RecA大量产生，促使阻遏蛋白CⅠ的水解

---把OL和OR从阻遏状态释放出来

---从PL转录使int和xis表达10.4异常重组—转座转座成分概述1、转座子(元)或转座元件(transposonortransposableelement):基因组中不必借助于同源序列就可自主复制和移位的基本单位转座（transposition）：由可转座/移位因子介导的DNA重排现象，分复制转座与非复制转座两类。2、发现和发展1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes

玉米果皮、糊粉层花斑突变

玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理

跳跃基因（jumpinggene）1947冷泉港实验室（美）BarbaraMcClintockDNAtransposableelement10.4.1

Ac-Ds系统（玉米的转座子）玉米中的控制因子

1938年MarcusRhoades首次发现不稳定突变等位基因（unstablemutantallele），即一种回复突变率很高的等位基因。不稳定是取决于不连锁的Dt基因的存在。McClintock。1940～1950描述了大量的控制因子A1:控制色素形成Dt:控制产生斑点

MarcusRhoades分析了一种墨西哥玉米的穗，此穗来自于一种籽粒有颜色的纯种自花受粉的玉米，但它在后代中表现出一种意外的双因子杂种修饰性孟德尔分离比原来的品系可能为A1A1dtdt，突变后产生A1a1Dtdt的植物，自交产生了上述比例。产生斑点的一种可能是在体细胞中产生了回复突变a1→A1,但大量的斑点需要很高频率的回复突变。Rhoades能在a1a1Dt_（花斑）特殊无性种植物的花中找到相应的花药，其花粉应携带回复突变产生色素的基因型，而他用这些花粉与a1a1的植株测交，结果有的后代完全是有颜色的。表明在亲本中每个斑点实际上是回复突变的。

这样a1成为首次发现的不稳定突变等位基因（unstablemutantallele）的例子。即一种回复突变率很高的等位基因。然而这种等位基因的不稳定是取决于不连锁的Dt基因的存在。一旦回复突变发生，它们就变得稳定了；即Dt基因能离开A1基因，这时A1表型不再改变。这样a1表型是由一个缺陷型的转座因子的插入而产生也就顺理成章了（缺陷的转座因子自己并不能移动）。Dt的缺乏使得表型保持稳定。叶片的花斑表型Phoades将基因型a1/a1;Dt/-的玉米发芽，检测它们是否带有在各组织中产生色素斑的基因玉米籽粒的花斑Ac-Ds系统10.4.2.1基因转座现象的再次发现与证实

在一个操纵子/元中，与操作子毗邻的结构基因发生终止突变后，它除了影响该基因本身产物的翻译外，还影响其后结构基因多肽的翻译，并且具有极性梯度的特征。

插入型极性突变的发现与机理（1967

Shapiro）Operon&PolarityMutation

极性突变的基本概念10.4.2原核生物中的转座子A酶活性

OZ基因终止突变位

点离O的距离

IpoZYA证实转座因子的实验(1)密度梯度离心实验:

dgl

m突变体密度大— 可能存在小的插入片段

dgl+/dgl

m

杂合双链DNA的电镜照片。出现了棒糖状结构—证实存在插入序列/转座子(2)分子杂

交实验

dgal+/dgal

m杂合双链DNA中的

茎环结构原核生物的转座子种类两种类型：简单转座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）复合转座子（compositetransposon

Tn）共同特征：a）两端有20～40bp的IRb）具有编码转座酶（transposase）的基因10.4.2.2

插入序列最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分命名：IS＋编号（鉴定类型）长度700～2000bp1）插入序列(IS)IS是最简单的转座子，不含有任何宿主基因，它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。λ：：IS1

特点：a）两端IR为转座酶的识别位点（突变）

b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（3～9bp）含有Is的质粒经变性后形成柄环结构IS可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体），常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应2)复合转座子,Tn复合转座子是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。复合转座子的转座能力由IS决定a)Tn/TnAfamily

l具有IR、转座酶基因、调节基因（解离酶）、抗抗生素基因

l

Tn1(AmpR)