第九章 植物细胞培养

第九章植物细胞培养第一节单细胞培养第二节细胞悬浮培养第三节植物细胞生长和活力的测定第四节植物细胞培养的应用

植物细胞培养，即对植物器官或愈伤组织上分离的单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。第一节单细胞培养一、定义单细胞培养：对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再经过分化形成芽、根等器官或胚状体，甚至长成完整植株的技术。二、意义1、建立单细胞无性系2、对培养的单细胞可以诱发突变3、排除体细胞干扰4、遗传转化受体的建立三、单细胞的分离叶组织是分离单细胞的最好材料，1、机械法：叶片组织轻轻研碎，匀浆过滤或离心，得到纯化细胞。特点：细胞不受酶伤害，不会发生质壁分离。

不适用于所有植物2、酶解法：利用果胶酶处理叶片，使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞。特点：必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞胀裂。四、单细胞培养方法（一）看护培养法

用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。（1）取处于活跃生长期约1厘米大小愈伤组织块。（2）无菌条件下，愈伤组织块安放在培养瓶中，在愈伤组织上放约1厘米平方的无菌滤纸片。置培养室中放过夜。（3）从悬浮培养物或疏松的愈伤组织上分离出单细胞，并把单细胞接种在培养瓶中的滤纸上面。（4）恒温培养。（二）微室培养法

人工制造一个小室（载玻片和盖玻片），将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。小室可通过毛细管与外界通气，便于观察。注意载玻片厚度1mm，微室厚度最好不超过20um，盖玻片厚度在0.17-0.18mm左右，观察效果才好。（三）平板培养法

平板培养法是把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。步骤：1、单细胞悬浮液的制备2、悬浮细胞密度的调制3、琼脂培养基的配制4、平板制作5、培养（四）条件培养基：在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。方法：把液体培养基中培养了4-6周的高密度细胞过滤掉，将其培养基制成液体培养基或固体培养基来培养单细胞或低密度细胞群体，这样可明显提高单细胞培养物存活和分裂的能力。第二节细胞悬浮培养细胞悬浮培养是使离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。建立在愈伤组织的液体培养技术基础上。目前已发展到全自动控制的大容积发酵罐的大规模工业生产的连续培养。为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验系统。1、愈伤组织诱导材料自来水冲洗——75%的乙醇擦洗——将材料切成小块（带形成层）——接种到MS+2,4-D2mg/L+CH500mg/L+琼脂0.8%,pH5.8的培养基上——得愈伤组织——扩大繁殖。2、单细胞悬浮液的制备愈伤组织转移到液体培养基中——4r/min转床培养10d——140m×140m的细胞筛过筛——使细胞密度达到10个/ml左右——得单细胞悬浮液。

一、前期准备

在细胞悬浮培养中，采用生长快、有效成分高、适合悬浮培养的细胞株。筛选细胞株的方法是：

（1）从培养的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长快的浅色愈伤组织。

（2）用振荡或酶法，游离出单个细胞或小细胞团。

（3）接种在固体培养基上培养2周。

（4）挑选生长快的细胞株并继代培养。

（5）取各细胞系的培养物，进行有效成分的测定，筛选出有效成分高而生长较快的细胞株。二、培养类型和方法（一）成批培养

指把细胞分装在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。

（1）细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的养分为细胞耗尽为止。

（2）用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在培养基中的均匀分布。

（3）在整个培养过程中，细胞数目会不断发生变化，呈现出明显的慢-快-慢，最后增长停止的细胞生长周期。

（4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。1、成批培养法细胞生长周期延滞期对数增长期直线生长期缓慢期静止期时间

细胞数目（二）半连续培养指每隔一定时间后倒出一半的悬浮液，并同时补充加入等量新鲜培养液。能重复地取得大量、均一的培养细胞，供生物研究之用。

是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。

在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。

（三）连续培养1、连续培养的特点

（1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。

（2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。细胞增殖速度快。

（3）适于大规模工业化生产。2、连续培养的种类

封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。

开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。

封闭型连续培养：在培养过程中，排除的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生长的需要。悬浮在排除液中的细胞经机械方法收集后再放回培养系统中，因此在这样培养方式中，随着培养时间延长，细胞密度不断增加。开放型连续培养：为了不使限制细胞生长的因子出现，创造一个稳定的细胞生长的环境，必须建立一套自动控制系统来调节培养基注入的数量和培养液的总体积。在开放连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流入和流出的速度，使细胞的生长速度一直保持在一个稳定状态，流出的细胞相当于培养系统中新细胞的增加数。3、为了保持在开放连续培养中细胞增殖的稳定性，采取的控制方法：

（1）浊度恒定法

（2）化学恒定法

三、悬浮细胞的继代在悬浮培养中，为了保持一定的悬浮细胞增殖速度和增殖量，应定期做继代培养，最适的周期一般为1-2周。但实际所需的时间和接种量应视不同细胞系而定。继代时间为1周的细胞系可用1：4的接种量，继代时间为2周的可用1：10的接种量。在悬浮培养中，细胞刚进入静止期之初，细胞悬浮液达到最大量，就必须进行继代培养。因为处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长会引起细胞的大量死亡和解体。为了加速细胞增殖，有的甚至在对数生长期末就进行继代。四、培养细胞的同步化同步培养：在培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段，同步性的程度以百分百分数表示。实现悬浮培养细胞同步化的方法：1、饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿后