第七章 核酶工程

第七章核酶工程1 近年来，酶学与其他学科交叉和渗透十分活跃，其研究领域得到了进一步扩展。 1873年发现第一个酶开始，经历了很长时间，在1936年得到结晶酶，才认识到酶是蛋白质。 1983—1986年已经认识到有些酶是由核酸组成，酶催化的本质是RNA。 例如核糖核酸酶，磷酸果糖激酶等2

原生动物四膜虫rRNA作用加工成成熟的26SrRNA.82年研究发现:(1)

四膜虫rRNA前体有6400个核苷酸，其中有两个外显子和一个内含子,成熟过程是内含子切除，两个外显子连接成成熟的rRNA，这个过程称为剪接。这个剪接过程不需要别的酶参与催化，不需要ATP等提供能源，靠5’-GMP、Mg2+参与。这种rRNA前体自我剪接功能的特性，排除了任何蛋白质的催化作用。3但当时有争议：1）它只是自身催化，而不能催化其他分子反应。2）一般意义上的酶催化剂在反应前后应该没有变化。而在rRNA前体成为成熟的rRNA，切去内含子后，它不再有催化能力。如(1)

四膜虫前体rRNA在低浓度阳离子下，切去一个内含子，余下部分连成成熟的rRNA，这种自我剪接是靠自己的前体rRNA。4rRNA自我剪接的前体加工功能与自身的结构有关。而且还发现高温、内含子互补的核苷酸序列、高浓度的变性剂等可以使之丧失自我剪接的加工功能。

进一步的研究发现，这种自我的剪接以后释放出来的内含子可以通过转磷酸酯反应自我环化。55’-G-IVS-G-3’(414nt)

去5’-GA-(15nt)-+成环(399nt)

去5’-4nt+开环(395nt)

开环后无法再环化线状395nt(称为L-19IVS)L-19IVS分子缺少内催化功能。但可以催化其他RNA分子a.转核苷酸作用b.水解作用c.转磷酸作用d.去磷酸作用e.RNA限制性内切酶作用

e作用时用天然和人工合成的RNA底物都有相同的结果。RNA内切酶与DNA内切酶作用一样，底物不同。6实验： 发现RNA催化剂的活性部位含多聚GMP，其作用是催化剂和底物形成非共价键而发挥作用。其催化中心是5’—GCAGGG—3’，L-19IVS中395个核苷酸3’-过碘消去G加入G

失去催化活性活性又有了如用点突变法作成5’-GCAGGG--,--GGCGGG-等一系列人工催化剂，可以限制性的水解相应的底物，表明不同催化剂的活性部位催化所对应的底物。7

天然与人工RNA催化剂的底物专一性RNA催化剂 （线状394ntRNA的22～27）底物产物5’3’I（5’3’）II

GGCCUCUA5（1）GGCCUCU＋GA5

GGCCUGUA5（2）G--------

-GGAGGG-GGCCGCUA5

（3） -------

(1) -------

-GCAGGG- (2) GGGCCUGU＋GA5

(3) ------

(1) ------

-GGCGGG-(2)G ------

(3)GGCCGCU＋GA5

8 通过这些研究，已经知道RNA催化剂的活性部位及其底物专一性。

RNA催化剂的这个特性，由人工制造出一系列新的催化剂，不断扩大其应用领域。

这些人工催化剂对竞争性抑制剂十分敏感。所以，这些催化剂具有蛋白质催化剂的一些特征。也可以满足生物催化剂所必需的结构要求。

9二个例子：RNaseP(核糖核酸酶)

蛋白质部分RNA部分作用催化tRNA前体的5’-端成为成熟的内切核酸酶组成1/4为protein，3/4为RNA,RNaseP-RNA叫RNaseP-蛋白质对酶作用不抗RNaseA对其有水解作用,抗胰蛋白酶作用对RNase分离后，RNase，蛋白质部分都没有活性，P分离 重新合并又有活性分别处理没有活性P-RNA，在﹥20mMMg++ 条件下，有RNaseP作用。 RNA部分用SDS-酚抽提或者 蛋白酶作用，都不受影响。体外转录 从E.coli的基因在体外转录，得到的产物RNaseP 前体，同样能加工tRNA前体，RNaseP-RNA前体和 RNaseP-蛋白质可以重组成全酶。10特定构象问题

P-RNA称为M1RNA，由377个核苷酸组成，RNaseP叫C5蛋白，它可以通过层析方法分开，也可以重新组成有活性全酶。另一蛋白质部分却没有活性，但可维持酶的特定构象。M1RNA在3’-去122个核苷酸，仍然有活性，5’去70个核苷酸，却没有活性。专一性问题蛋白质部分（C5蛋白），是维持酶活性构象所必需的，可促进酶反应速度。如加入适当的两个部分，可以提高酶活性2～4倍。C5蛋白具有底物专一性，且用精胺和亚精胺不能替代。11ribozyme的种类：1）分催化分子内反应自我剪切（self-cleavage)2）分子间反应自我剪接(ribozyme)自我剪接ribozyme四膜虫前体rRNA切出的一个内含子，就是这个类型。有两种作用：1）一个是分子内部的作用2）另一个是作用于分子之间尤其是分子之间的作用，这两个作用最引人注目。12一个类型自我剪接要GMP和Mg2+,而且在离体条件下，还可以催化分子间的反应，一个是CpU+GpN-----CpUpN+G，另一个是--U+GpN------UpN--+G另一类型自我催化不要GMP,但是要Mg2+，而在细胞核mRNA前体的剪接需要核小分子核糖核蛋白参与反应。

自我剪切（self-cleavage)特点： 如T4RNA前体在没有酶参与下能进行自我剪切，而加入非离子去污剂后可以促进反应。这种自我剪切反应在病毒、类病毒当中可以见到。13催化分子间反应的自我剪切如L-19IVS那样具有5种催化活性。a.转核苷酸作用b.水解作用c.转磷酸作用,d.去磷酸作用e.RNA限制性内切酶作用 另外，通过定点突变人工制造出目前还没有的RNA限制性内切酶。

M1RNA在一定条件下有RNaseP全酶的活性。已发现不同细菌中的RNaseP-RNA的核苷酸顺序有不同，可以与RNaseP-蛋白质交叉重组，得到不同的组合RNaseP。14真核生物的RNaseP-RNA具有原核生物RNaseP-RNA相似的活性和一些理化性质，但分子量相对较小。尤其通过对真核生物的RNaseP结构与功能的研究，已经知道一类结构相似的小分子可成为我们所需要的催化剂。通过对原核生物RNaseP结构与功能的研究，成功构建了比较小的成熟ribozyme，比原来还小大约150bt的ribozyme。15 又如兔肌1,4-葡萄糖分支酶是一个RNA-蛋白质复合物。RNA部分只有31个核苷酸，而且发现其中有8种经过修饰的核苷酸10个。第一次知道这种酶底物不是RNA的ribozyme。

1990年发现底物是DNA的ribozyme

1992年发现底物是氨基酸酯的ribozyme，而且知道它具有多种催化功能(氨酰tRNA合成、肽基转移酶）等。16第一节天然核酶到目前为止，在自然界中发现的核酶根据其催化的反应可以分成两大类：

剪切型核酶，这类酶催化自身或异体RNA的切割，主要包括锤型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白质－RNA复合酶（RNaseP）

剪接型核酶，主要包括组I内含子和组II内含子，实现mRNA前体自我拼接，具有核酸内切酶和连接酶两种活性。17锤头型核酶锤头结构（hammerheadstructure）状二级结构，由13个（后来证明只需11个）保守核苷酸残基和3个螺旋结构构成（图7－1）只要具备锤头状二级结构和13个保守核苷酸，剪切反应就会在锤头结构的右上方GUX序列的3’端发生无论是天然的还是人工合成的锤头结构都由两部分构成：催化结构域（R）和底物结合结构域（S）1819锤头型核酶催化反应可能的机制：“单金属氢氧化物离子模型”（图7－2(a)）,金属氢氧化物作为广义碱从2’-羟基获得一个质子，这个被活化了的2’-羟基作为亲核基团攻击切割位点的磷酸“双金属离子模型”（图7－2(b)），金属离子作为Lewis酸接收2’和5’-羟基的电子，极化并减弱O－H键或O－P键

HDV（丁型肝炎病毒）中的核酶显示了不同的催化机制（图7－2(C)），胞嘧啶充当一般碱，咪唑环上的N吸引2’-羟基上的质子，活化羟基上的O，这个O亲核攻击相邻核酸骨架上的P并使磷酸酯键断裂202122发夹型核酶发夹状二级结构，由50个碱基的核酶和14个碱基的底物形成，包括4个螺旋和5个突环（图7－3）23蛋白质－RNA复合酶由蛋白质和RNA两个组分构成如大肠杆菌tRNA5’成熟酶，主要催化tRNA前体成熟过程，M1RNA组分单独具有全酶活性，蛋白质只维护M1RNA的构象锤头型和发夹型核酶及HDV

RNA、链孢霉线粒体RNA等切割底物RNA后的产物都是3’端的2’-3’环磷键及新5’端羟基；蛋白质-RNA复合酶催化得到的产物的3’端是羟基，5’端是磷酸24端粒酶实际上是一个核糖核蛋白复合体由RNA成分结合蛋白质亚单位共同组成用Rnase破坏RNA成分用蛋白酶K破坏蛋白质成分端粒酶完全无活性端粒酶完全失去活性25端粒酶在表达上：

RNA成分和结合蛋白质成分两者缺一不可。在表达的调控上：

RNA成分和结合蛋白质成分两者是分离的。结合蛋白质成分总是与酶活性同时出现或者都不存在。26

在人体细胞抽提液中，端粒酶全酶与hTERT（humantelomerasereversetranscriptase)有共沉淀现象。表明hTERT与端粒酶活性间的密切关系。体外试验中将人端粒酶模板成分hTR（humantelomeraseRNAcomponent)与hTERT混合可重构端粒酶活性。

27端粒酶与衰老有关

在端粒酶阴性的二倍体细胞中转入编码hTERT的基因，也可激活端粒酶，结果DNA分子端粒长度增加，细胞寿命延长，老化过程减缓，但其核型及表型均保持正常，没有恶性转变的迹象。在临床肿瘤组织样本中也发现，hTR通常在正常组织及肿瘤组织中均能检测到，但hTERT只特异性表达于肿瘤组织。28所有这一切说明，蛋白催化亚单位是端粒酶活性的限制因素。

端粒酶激活可能是一个多步骤过程，至少包括以下两个层次:其一是端粒酶RNA成分的上调；其二是蛋白组分特别是催化亚单位的表达。所以，现在已经知道端粒酶与细胞衰老和肿瘤有关系。细胞分裂一次，认为在端区丢失(50～200bp/代)可以控制细胞分裂，被看成是一个分裂钟。29

同时，端粒酶的活性与肿瘤的诊断和预后的评估直接有关。 有关端粒酶研究的报道很多，到1998年，己超过3000篇。根据资料分析，85%以上的肿瘤样本表达端粒酶活性．只有少数几种肿瘤端粒酶阳性率相对较低（如在成胶质细胞瘤阳性率为55%～75%,成视网膜细肥瘤为50%，脑脊膜瘤和星形细胞瘤中更低一些）。 但是已经看出端粒酶活性是迄今所知的人体肿瘤的特异性最强的生物标志，因而对临床肿瘤病人的诊断与治疗有重要意义。30端粒酶活性分析作为肿瘤诊断指标的另外一个优点是在某些肿瘤类型，恶变前端粒酶已被激活，随着肿瘤进展，端粒酶活性逐渐上升端粒酶活性监测可作为早期诊断或预警的一个指标。如在宫颈部位，从宫颈上皮内增生到出现明显症状的肿瘤这一过程，是与端粒酶活性的上升密切相关的。在前列腺肿瘤形成过程中也有类似情况，从出现良性增生到前列腺癌变的整个进展过程，端粒酶活性一直上升端粒酶活性也是肿瘤患者预后评估的良好指标，如胃癌患者，端粒酶往往与肿瘤尺寸，转移情况和患者存活时间相关31

另外，在白血病、脑脊瘤和乳腺癌患者，端粒酶往往与肿瘤大小、转移情况、存活时间相关。端粒酶活性高预后不良，端粒酶活性越高，预后越差。端粒酶还作为肿瘤治疗的作用靶位，从最先发现瑞粒酶可延仰端粒长度起，就认为端粒酶抑制剂可阻止细胞的恶性分裂增殖，因而有可能用于抗肿瘤。 近来对以端粒酶为作用靶点的抗肿瘤研究非活跃。32代表性的研究方向有1.阻断端粒酶RNA的模板作用来抑制端粒酶活性（比如通过反义核酸技术或构建锤头状核酶破坏端粒酶RNA的模板功能）2.逆转录酶抑制剂3.核苷酸类似物4.蛋白激酶C抑制剂5.细胞分化诱导剂前4种途径因作用太广泛，特异性不高，毒副作用明显，进展不大。其中细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性的研究是进展最明显的。为了确定永生化细胞的表型分化是否与端粒酶活性调控有关。33组I内含子和组II内含子组I内含子（groupIintron）和组II内含子（groupIIintron）这类核酸比较复杂，通常包括200个以上的核苷酸，主要催化mRNA前体的拼接反应。组I内含子核酶催化反应可以在体外无蛋白质参与下除掉自身内含子，包括两个连续的转酯反应，并且需要Mg2+或Mn2+及鸟苷（或鸟苷酸）的参与组I内含子还可催化各种分子间反应，包括剪切RNA和DNA、RNA聚合、模板RNA连接等组I内含子和组II内含子的主要差别是第一步反应的化学机制，在I中，外部的鸟苷的3’-羟基作为进攻基团，而在II中，是内部腺苷的2’-羟基起作用34组I内含子和组II内含子的剪切机制如图7－4所示35第二节功能性核酸的体外选择体外选择（invitroselection）或指数扩增法系统进化配体（systematicevolutionofligandsbyexponentialamplification,SELEX）是从顺序随机的RNA或DNA分子构成的大容量随机分子库出发，在其中筛选得到极少数具有特定功能的分子。这些技术拓宽了对核酸分子催化能力的认识，同时提供了新型的医疗诊断试剂。36功能性核酸筛选的基本思想在一个顺序随机的RNA分子库中，通过一定的筛选方法，得到极微量的具有某种功能（切割或连接核酸分子、与配体结合等）的RNA分子，然后用RT－PCR将这些微量到难以检测的分子扩增，再对PCR产物进行序列分析以及其他各种性质的测定。利用待筛选分子的可遗传特性，将分子的基因型和表现型联系起来，在筛选得到具有目的性质的表现型的同时也获得了可以体现这种性质的基因型。37对RNA和靶分子的结合能力的筛选最早体现这种筛选思想的是20世纪60年代利用RNA噬菌体Q进行的实验，该病毒的基因组可以在体外被Q复制酶扩增。该实验的另一个先进思想是通过在体外反应体系中加入EB或改变四种dNTP的浓度来增加基因组复制过程中的突变率。用化学法合成的DNA分子可以在其链的任何位置上引入完全随机的顺序；反转录酶和PCR技术的应用使人们可以在体外条件下不必依靠Q复制系统就能很容易的扩增出几乎任何的核酸系列。所有这些开发出多种RNA分子的体外选择和定向进化方法，为获得新功能的RNA创造了条件。38RNA适体在体外选择中得到的可以与目标分子结合的RNA分子称为目标分子的RNA适体（aptamer）。适体是能与有机物或蛋白质等配体专一、高效结合的RNA或DNA片段，分别称为RNA适体或DNA适体。筛选一种适体的一般方案如图7－5所示。功能性核酸通常含有