第五章 基因药物专题

生物制药技术

蔡谨676417）Caij@浙江大学玉泉校区教十5212室

Chapter5GeneMedicine(genetherapy)1.概念基因：染色体上的DNA片段，是遗传信息结构和功能的基本单位。基因决定生老病死控制高矮胖瘦影响喜怒哀乐基因组：某一生物的细胞中所带有的全部遗传信息。一.概述基因与疾病基因与人类的疾病密切相关：遗传病是由于基因先天缺陷所致;肿瘤的发生涉及多种基因改变,包括癌基因激活或抑癌基因失活;高血压,糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变;由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关,存在易感人群和耐受人群.

基因药物：

将具有治疗作用的基因重组进真核表达载体，直接转移到人体细胞，表达出具有治疗作用的蛋白质和多肽，从而达到治疗作用的新方法。TheapplicationofgeneticprinciplesinthetreatmentofhumandiseaseByintroductionofgenetic

materialintotargetcellsinordertocounteracttheeffectofadiseasegeneorintroduceanewfunction

“Youmayneverhavetopurifyaprotein,ormanufactureadrug,youjusthavetomakethevectorandgetintothepatient.Whybothermarketingit?Youcanjustletthecelldoit.”

Prof.JumWilsome,美国基因治疗中心主任基因治疗的必要条件UnderstandingofthediseaseprocessStructure/functionofgenetobeintroducedEfficientdeliveryofgenecontrolofgeneexpressionPrevention/controlofimmuneresponsesAnimalmodelandassessmentoffunctionClinicaltrial研究基因治疗的三个基本步骤

寻找适当的靶细胞

导入目的基因

基因表达分类生殖细胞基因治疗（germlinegenetherapy）生殖细胞或早期胚胎细胞体细胞基因治疗(somatic-cellgenetherapy)体细胞

体细胞基因治疗始终需要考虑的问题

基因转移的效率

治疗的特异性

基因表达的持久性及其调节

治疗的毒副作用

什么疾病

什么基因

什么载体

什么靶器官和靶细胞

什么基因导入方法二、基因治疗和传统的基因工程的区别

二者都着眼于寻找可治病或有其他应用价值的“目的基因”。基因工程：目的基因——载体——导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞——体外表达所需要的蛋白——经过分离纯化获得能用于治疗或其他用途的蛋白纯品,最终是制造出一种蛋白类的药物。

基因治疗——目的基因——载体——导入人体，目的基因在人体内的细胞中制造所需要的蛋白——达到治病的目的。基因治疗在技术上一旦成功,其优势：①制品为基因及其载体，非基因表达蛋白产物,不需复杂的蛋白产物分离和纯化工艺②生产成本远远低于基因工程产品③从理论上讲,凡能治病的基因，都有可能开发成为“药物”④半衰期多肽药物基因药物产物多肽－蛋白质基因载体无信号肽有信号肽宿主细胞大肠杆菌酵母等人体细胞（体内）转染容易难生产工艺复杂较简单纯化复杂较简单成本高较经济稳定性低高保存难易半衰期短长用法长期注射一次性注射副作用高低

但基因治疗难度高，技术要求极为苛刻。例如，针对各种疾病，必须具有能够达到治病目的的基因。在此基础上，还必须具有能有效地将基因导入人体的载体系统，这种系统要求高效，而且能定向地导入人体某种细胞。基因导入人体后，必须能够控制它的表达。

因此，基因治疗是生物高技术的高度集成，是遗传学、分子生物学、细胞生物学、分子病毒学等多种学科知识和技术的高度综合。

三、基因治疗的主要策略

GenereplacementGeneaugmentationtherapy(GAT)Genecorrection(Chimeraplasty)TargetedkillingofspecificcellsTargetedinhibitionofgeneexpression(Geneablation)Genereplacement:

Deficientgenecorrectedbyreplacingthemutatedallelewithanintactallele;usedforthetreatmentofautosomaldominantdisorders.Thestrategiesareasfollows:a)kockoutmutationbysinglecrossing-over(insertionalinactivation)

b)genereplacementbydouble(reciprocal)crossing-over

c)targetgeneinhibitionindominantnegativegeneticdisorders;usuallymutatedproteinswhichinteractwithnormalcellularproteinstocreatealteredproperties;mutationalinactivationoftheonemutatedcopywillalleviatethismutantphenotype;themutationcanbecarriedoutbyinsertionalinactivation,orantisensetechnology.GeneAugmentationTherapy(GAT)

FordiseasescausedbylossofgenefunctionmorecopiesofnormalgeneraiselevelsofgeneproductrestorenormalphenotypeApplyto:monogenicrecessivediseasescysticfibrosis,haemophilia,musculardystrophyGeneCorrection-ChimeraplastytumourcelltkthymidinekinasegeneviralvectorganciclovirganciclovirphosphateTargetedKilling–GeneticPro-drugActivationTherapyTargetedinhibitionofgeneexpression

Ribozymes

-cancleave(orrepair)mRNATriplehelixoligonucleotides-blockgenetranscription

Antisense

oligos-blockmRNAtranslationAllgenetherapystrategiesdependongettingthegeneorgeneticmaterialintothetargetcells!!!

治疗方式矫正性基因治疗基因置换（genereplacement）基因矫正(genecorrection)基因增强(geneaugmentation)调控性基因治疗调控基因的表达来达到改善疾病的目的（1）反义技术A）反义基因到载体，耙细胞到反义RNA，封闭mRNA的翻译B)合成反义寡聚脱氧核苷酸，化学修饰导入体内，胞吞与DNA结合形成核苷酸三聚体，与转录因子结合，转录不能启动；或与mRNA结合形成RNA-DNA杂链，影响基因的表达。C）核酶

具有催化作用的RNA分子，能催化切割降解异常表达基因的RNA分子，已经设计出特殊的核酶。（2）通过其他基因的代偿作用弥补缺陷基因的功能。四.基因转移体系若干相关术语：

Transfection转染：过去：将病毒DNA或RNA

转入细胞。

现在：将外源DNA转入动物细胞。

DNATransfer转移：基因导入或转移广义的概念。

Transduction转导：噬菌体介导的细菌之间的基因

转移。

Transformation转化：将裸DNA或质粒导入原核

和真核细胞。转移途径

1）exvivo法，体外途径。体外基因导入人体细胞，再将细胞植入人体。经典，安全，效果较易控制，对基因转移效率要求不高，但步骤多，复杂，难度大。

2)invivo法，体内途径。将含治疗基因的重组载体直接植入体内。操作简单，容易推广，但对基因转移技术要求高。aaaaaaEx-vivoIn-vivotopicaldeliveryIn-vivosystemicdeliveryVExamples:-bonemarrow-livercells-skincellsExamples:-brain-muscle-eye-joints-tumorsExamples:-Intrav－enous-intra-arterial-intra-peritonealTHREEclassesofanatomicalgenedelivery基因治疗过程中的基因转移方法

Viralvectors

Non-viralvectors

Physicalmethods

目前最有效的是病毒载体，但存在插入大小有限、免疫原性强和生产难等局限1、病毒载体类型反转录病毒（RV）载体retrovirus腺病毒（AV）载体adenovirus

腺相关病毒（AAV）载体Adeno-associatedvirus单纯疱疹病毒（HSV）载体herpessimplexvirus

慢病毒（lentivirus)载体等对载体的基本要求：特异并有效的基因转移特异、高效、持续性表达，具有可控性免疫原性低易于生产载体特征：

reproducibility stablepropagated purifiedtohightiters mediatedtargeteddelivery基因治疗病毒载体比较

RVAVAAVHSVLV基因组成ssRNAdsDNAssDNAdsDNAdsRNA基因组长度10kb36kb5kb152kb10kb装载容量<8kb8kb4.5kb30kb9kb病毒滴度107

1011

108

108108感染细胞谱窄宽宽窄宽感染能力中很强强强中整合能力有无有无强毒性作用遗传毒细胞毒遗传毒细胞毒遗传毒免疫原性弱中等弱强弱病毒型载体逆转录病毒腺病毒疱疹病毒腺相关病毒慢病毒优点:●安全，对人体低病原性●针对增殖的细胞●长期稳定表达●外源基因插入能力适中。缺点:●导入率低●随机整合到宿主细胞，有插入性基因突变或癌变的危险●无导向性。优点:●高效导入、高滴度●非增殖细胞也能导入，对遗传、代谢病有利●基因插入能力强（<30kb）●宿主广泛缺点:●有严重的免疫反应。●无导向性优点:●无细胞毒性，无免疫反应●转导稳定，长期表达●具有在特定位点整合的潜力，导入基因后可特殊表达●个体小，可广泛分布。缺点:●可做到高滴度,但包装困难●有随机整合的可能●基因插入量有限（<5kb）优点:●有嗜神经性，可用于神经系统疾病●有环状分子形式的潜伏状态●基因插入容量大。缺点:●细胞毒性和免疫原性不定●潜伏期HSV-1可能回复突变为野生型,导致脑炎或死亡优点:●能转导神经细胞●中等插入量。缺点:●随机整合●可能回复突变为野生型。retrovirusadenovirusHSVAAVlentivirus反转录病毒载体基因转移系统辅助细胞:

将含有病毒结构基因但缺失了顺式包装信号的缺陷型反转录病毒导入哺乳动物细胞（ψ—2，PA317，ψCRIP）。可产生病毒包装蛋白但不产生病毒颗粒；反转录病毒载体:以外源目的基因替换病毒结构基因,含病毒包装信号辅助细胞提供载体包装蛋白，使后者产生含外源目的基因的病毒颗粒

缺陷型的反转录病毒颗粒的RNA进入靶细胞后，变成前病毒并整合到宿主细胞的染色体上，可稳定表达外源基因。反转录病毒只能感染处于增殖期的细胞。

反转录病毒安全性问题病毒感染的可能性病毒在靶细胞基因组整合可导致:

破坏细胞正常生长必需的抑癌基因

LTR激活原癌基因染色体重排激活原癌基因腺相关病毒（AAV）载体：4.7kb单链DNA，结构为ITR-rep-cap-ITR，病毒基因组简单，易于消除，可降低细胞毒性和T-淋巴细胞反应的危险性；病毒DNA可在人19号染色体上进行位点特异性整合，需要辅助因子出现才复制；其Rep蛋白可能介导这种定向整合宿主范围宽，易感染造血干细胞，能潜伏感染非分裂期细胞；在动物模型中表达可持续半年以上。但AAV载体接纳的外源DNA小于4.5kb，载体整合效率较低，制备困难HSV病毒双链DNA,包括:HSV-1,2,VZV,EB,CMV.

主要以HSV-1型为主.HSV载体含包装信号,复制位点等顺序结构,HSV病毒启动子,目的基因表达框架.由辅助病毒共转染辅助细胞M64A,制备重组病毒.

辅助病毒的改造:IE3温度敏感突变型;

缺失突变型:IE3缺失;

应用:感染心肌细胞,神经元,神经胶质细胞.VEGF---血管形成;脑肿瘤;帕金森病

Lentivirus（慢病毒载体）优点:感染非分裂细胞，有RV优势结构:LTR-gag-pol--env--LTR

TARtat,rev,tev应用:宿主广泛;艾滋病基因治疗问题:安全性2、非病毒及物理方法脂质体介导法磷酸钙转染法机械法（显微注射、基因枪等）DEAE-葡聚糖和polybrene(聚凝胺)转染法电穿孔法超声波辅助法纳米材料等中性脂质体

由脂类形成的可高效包装DNA的人造单层膜，其结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，细胞的内吞作用使其进入细胞，操作简单，转染效率可高达50%，可用于体内试验，但目的基因表达不稳定阳离子脂质体：阳离子脂质体在水中可形成大小约100-400nm单层脂质体。其带正电，带负电的DNA可自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，与细胞膜作用使DNA进入细胞。在该系统体内基因导入效率低，且无靶向性。在体内应用，除肿瘤瘤内注射外，其前景仍存在问题。磷酸钙转染法：将氯化钙、目的DNA和磷酸缓冲液混合，沉淀形成含有DNA的极小的不溶性磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜，通过胞饮进入受体细胞的细胞质，转染过程简单有效，适用于贴壁、非贴壁细胞，转染效率可达20%左右，但目的基因表达不稳定机械法

如显微注射和基因枪（biolisticparticle）。显微注射使用一根细针头将外源DNA直接转入受体细胞核。基因枪使用高压DNA分子导入细胞。

基因枪工作原理显微注射电穿孔法通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导目的DNA。细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。DEAE-葡聚糖和polybrene转染法

带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的外源DNA分子作用，使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将外源DNA导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。

裸DNA基因转移和治疗进展 展望裸DNA肌肉注射，活体转移 非病毒基因转移越来越重要电击促进质粒DNA进入肌肉皮肤 未来几年遗传病临床试验将首选血友病血管内导入质粒DNA，肝细胞基因转移 Duchenne肌营养不良，关节炎等尾静脉导入pDNA，简单有效，转染大、啮齿类的尾静脉注射作为快速检测表小鼠肝细胞达状况和基因治疗方法广泛应用pDNA表达载体可高水平持续表达 血管内裸DNA导入为细胞有效涉入pDNA RNAi将在基因治疗领域中成为重要手裸DNA导入法已经在临床研究（PAOD，段外周动脉闭锁症）SiRNA可通过血管内基因转移法有效导入Knockout小鼠基因治疗载体的发展趋势综合病毒载体与非病毒载体的优势,构建杂种病毒载体其需要达到的境界：靶向性进入特异细胞表达持久、可控、安全、高效商业化定做（tailor

made)依据特异的治疗 依据不同个体五.细胞的选择体外基因治疗靶细胞的基本要求：1.应来自受治者。2.可以或容易从体内获得。3.容易在体外培养和大量扩增。4.易被重组基因转染。5.输回体内能确保携带的目的基因稳定表达。6.能在体内存活一段时间。7.不影响临近组织的正常生理功能。基因治疗常用细胞★1.骨髓细胞

►造血干细胞。优点：●源自造血干细胞的细胞遍布全身，几乎存在于所有器官组织，可治疗一些与其不直接相关的疾病。●有些遗传病直接与其有关。缺点：●改造的细胞很少。●治疗基因在细胞中表达的时间太短。●干细胞分化导致基因失活。●有些遗传病与造血干细胞完全无关

特点：

●可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪或肌肉细胞、神经胶质细胞等，也可分化为造血干细胞和基质细胞。●可利用定向分化的生长因子转入干