第三章 生化参数测量及仪器

3.1生化参数测量技术3.2血气分析与经皮血气分析仪3.3电解质分析仪3.4其他技术第三章生化参数测量及仪器本章提要本章主要参考生物医学测量与仪器--原理与设计（西安交大出版社，李天钢、马春晓）讲义3.1生化参数测量技术

1引言生化参数测量在医院的各种检查中已占有十分重要的地位，为疾病的预防、诊断、治疗及医学基础研究提供重要的生物化学数据，成为临床检验中必不可少的组成部分。例如：血液pH值及血气(血液中的氧气和二氧化碳等气体成分)测量血、尿、脑脊液等体液中的电解质测量血清蛋白电泳等生化参数测量所涉及的内容很广，各种有关生物机体的化学结构和物质代谢的测量都属于生化参数测量。它对了解生命过程的特征、生物机体的生理病理变化机制和各种疾病的诊断等都有重要意义。现今医院中，为了诊断疾病所做的各种检查中生化参数测量占2／3以上，血液、尿及其他体液的生化分析，已成为疾病诊断必不可少的指标。

生化参数测量的特点样品量有限制。样品在质上有限制（同一样品不可能再次得到）。要求从一个样品能同时给出多种项目的分析结果。生物样品中含有多种待检测的成分，且各种成份的浓度差异极大。（10-3～10-12mol/L）医院每天作常规检查需要处理数百上千的样品。生化参数测量仪器的要求①高灵敏度；②高准确度；③高选择性；④操作简单；⑤操作自动化。活体使用的化学传感器的最基本要求2生化参数的测量与分析技术生化参数的测量方法很多，常见的有光度法、色谱法、电化学分析法、电泳法等。1)光度法光度法是利用物质光学吸收特性定量测定物质组分及含量的方法。光度法包括比色法分光光度法、荧光法、浊度法和原子吸收光度法等。比色法：利用有色物质对特定波长光的吸收特性来做定量分析，例如液体颜色深浅不同对光吸收强弱不同，来测定物质含量。常做成光电比色计，其优点：灵敏度高，准确，操作简单。分光光度法：根据比尔光吸收定律来测定物质对某一区域不同波长光的吸收程度，来测出溶液中该物质的吸收光谱或浓度。荧光法：利用某些物质在紫外光照下能发出波长大于照射波长的光（即荧光）的特性，通过测量发射的荧光波长以及强度，可以对物质进行定性或者定量分析。浊度法：依据悬浮溶液中颗粒对光线的散射特性，来测定待测组分的含量。原子吸收光度法：利用各种元素的物质在受到外来能量激发而变为原子状态时，能吸收特定波长的光的特性，通过测量吸收波长以及吸收程度，来检测某元素及其含量。分光光度测量技术定义:分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术.特点:灵敏,精确,快速和简便,在复杂组分系统中,不需要分离,即能检测出其中所含的极少量物质.应用:生物化学研究中广泛使用的方法之一,广泛用于糖,蛋白质,核酸,酶等的快速定量检测.

分光光度计工作原理：人眼可见的光只占电磁波谱的很小—部分(400~760nm)它是一种频率较大的电磁波.电磁波按频率大小,从频率最小的无线电波到频率最大的γ-射线排成一列,即组成电磁波的波谱基本原理：Beer定理改变入射光波长，并依次记录物质对不同波长光的吸收程度，就得到该物质的吸收光谱。每种物质都有其特定的吸收光谱紫外线－可见光分光光度计属于分子吸收光谱仪，分析波长范围一般为200nm～800nm分光光度法是比色法的发展，后者只限于在可见光区，前者则可以扩展到紫外光区和红外光区。分光光度计的分类红外分光光度计:测定波长范围为大于760nm的红外光区可见光分光光度计:测定波长范围为400~760nm的可见光区紫外分光光度计:测定波长范围为200～400nm的紫外光区

2)色谱法色谱法用于分离密切相关的化学物质。依据：被测物质在固定相和流动相的移动速度不同，造成速度差异的原因是由于该物质在固定相和流动相中的溶解能力(可溶性)不同。将被测样品加入流动相，若它的可溶性在固定相中较低，则各种组成成分在流动相中流动得较快。可通过流动速率来识别不同成分：流动速率Rf=被分析成分的运动速度V1/流动相的运动速度V2色谱技术（层析仪）它是为了解决样品中多成分分析而发展起来的一种分离技术，可以把不同成分的混合物分离为单独的组分。色谱法是一种分离技术，试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。固定相可以是固定物质和液体，液体可借助于多孔固体介质而使之不动。流动相为液体(有机溶剂)或气体(通常是氦气)。使用液体时称为液体色谱法，使用气体时称为气体色谱法。这两种方法用来分离那些能够变成溶液或气体形式的物质。色谱法的原理示意图：将样品引入并通过这个系统后，其组成成分在流动相和固定相中的可溶性不同而各自分离，并在输出口用不同的探测技术指示这个过程。色谱仪的输出信息色谱图基线色谱峰进样峰和空气峰保留时间死时间和死体积色谱法分类气相色谱：流动相为气体（称为载气）。液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。气相色谱仪气体相氦气、氮气、氢气固定相硅氧烷聚合体（涂抹在毛细管上）探测器测量的是载气中通过检测器组分浓度瞬间的变化，检测信号值与组分的浓度成正比。高效液相色谱仪流动相：水或烃类固体相：5～10um的精细颗粒探测器：紫外探测器3)电化学电极电位法利用一些对离子有选择性响应的电极电位与离子浓度间的相关性，测定溶液中离子的浓度。广泛用于：血气测量（血液中的氧、二氧化碳气体）酸碱度测量（pH值）电解质分析（包括钾、钠、氯、钙、镁等）从灵敏度、选择性和自动化等方面来看，分光光度法和色谱法都可以满足临床检验的要求；但从技术简单、造价低廉角度看，电化学电极法则更有优越性。溶液的电化学性质是指电解质溶液通电时，其电位、电流、电导和电量等电化学特性随化学组分和浓度而变化的性质。电化学电极分析法是测量由氧化还原反应、离子在两相的选择分布和透过膜等过程产生的电流和电压来进行物质分析的。电化学电极利用电化学原理把化学量转化为电位或者电流量的装置电解质在水中溶解形成离子，液体中有电池存在时，离子运动形成电流需要一对接口器件把离子电流转化为电子电流——电极被测对象的量反应为电位的传感器称为电位传感器——电位法电位法电位法的实质是通过在零电流条件下测定两电极间的电位差。基础是：Nernst方程离子选择法,电位滴定法参比电极指示电极Nernst方程：

E0为标准半电池电位，取决于电极使用材料、液体中离子浓度及外界温度。一般取25℃将材料置于含有该材料阳离子浓度为单位浓度电解液中以标准氢电极为参考测得的电位为E0。R是气体常数，其值8.314JK-1·mol-1T是热力学温度F为法拉第常数，其值9.65×104C/molaA+和aA分别表示两种状态原子的活性a)电极电位和参考电极参考电极：电极电势已知、恒定，且与被测溶液组成无关，则称之为参考电极。Ag-AgCl电极氢电极H2↔2H＋

+2e-理想的参考电极为：（1）电极反应可逆，符合Nernst方程（2）电势不随时间变化（3）微小电流流过时，能迅速恢复原状（4）温度影响小b)指示电极理想的指示电极对离子浓度变化响应快、重现性好。有两类可基本满足以上要求：金属电极与离子选择性电极。c)离子选择性电极离子选择性膜：离子浓度变化反映为膜两侧的电位差，电位差变化由膜两侧溶液中的电极测量。理想离子选择性电极的膜只有一种特定的离子能够通过。实际上，只要一种膜对某种离子的通透性远远高于其它离子，就可以作为离子选择性膜。离子选择性电极测量系统图离子选择电位法

——利用一些对离子有选择性响应的电极的电位与离子浓度间的相关性来测定溶液中氢离子和其他离子浓度的一种分析方法。所用的仪器是由离子选择电极和精密的电极测定仪所构成。在临床中广泛应用的有测定血液酸碱度计（pH计）、测定体液中钠、钾、钙等离子的电解质分析仪和测定PO2、PCO2的血气分析仪等。4)电泳法在直流电场下，带电粒子（分子均带电荷）在电解质溶液中逆电场方向移动（泳动）的现象称为电泳。相同条件下，带电量不同、大小不同的粒子泳动速度不同。经过一定的泳动时间后，不同性质的带电粒子将集中到不同区域，从而使样品中的各种组分互相分离，如下图。这样可对样品进行分类，并进行定量和定性分析，称为电泳法。在临床上，电泳法主要用于血清白蛋白分类、血红蛋白分类以及酶、肽类、氨基酸等大分子量（104-105）的生物组分的分离分析。电泳法

平板凝胶

毛细管电泳法（HPCE）是一种高效的方法。它利用毛细管代替平板凝胶，使分离效率提高。另外，毛细管电泳法使得分离机制大大扩展，从而拓宽了电泳法的应用范围。目前，电泳法不再局限于分离大分子，还可在一次分析中同时分离阳离子、阴离子及中性物质。3.2血气分析与经皮血气分析仪

血气分析仪血气是指血液中氧和二氧化碳气体。血气分析仪能测出PO2，PCO2，PH值等多种重要的血液参数。其它参数实际碳酸氢根浓度(AB)、标准碳酸氢根浓度(SB)、血液缓冲碱(BB)、血浆二氧化碳总量(TCO2)、血液碱剩余(BEblood)、细胞外液碱剩余(BEECF)、血氧饱和度(SO2)主要用作呼吸功能诊断和酸碱平衡诊断。pH值与血气测量血液中的酸碱度（pH）以及O2和CO2气体是反映血液酸碱平衡状态的常用指标，可以用来鉴别酸碱失调的种类。1)化学电极法pH值常用电极电位法，即利用电极电位与被测溶液中离子浓度的关系来测定H+的浓度，其电极称为pH电极（玻璃电极）。血液pH测量

pO2反映血浆中的溶解氧量,采用氧电极测量。血液或血浆中的氧分压反映了肺和血液之间的氧交换量，并反映血液自全身各部组织输送氧的能力。氧分压的测定氧电极是由铬丝电极作为阴极、Ag－AgCI电极作为阳极，用透氧膜覆盖电极顶端，膜和电极间放入电解液KCI，膜只允许血液中的氧分子与电极接触，这种电极通常称为克拉克（Clark）电极。氧电极可测量离体血液标本，也可置于血管内或皮肤表面（经皮）测量血氧分压。

血中二氧化碳测定pCO2也可用电极电位法测量CO2透过薄膜溶解在电极的外缓冲液中，使电解液的pH值随pCO2呈对数变化，通过测量电解液中的pH值，就能实现对pCO2的测量。血中二氧化碳测定二氧化碳分压的测定常用的二氧化碳分压电极是PH电极的改良型，它只对CO2产生反应。Severinghaus电极。常将3个电极安装在一起构成组合电极。测量时血液流进测量室，不同电极分别响应，测出各个值来。2)光电极法光电极内所含染料的荧光数量会随pH、pO2和pCO2变化，当动脉血样注入样品室时，即可同时测定pH值和血气值。血气分析仪工作原理图一个微机控制的便携式血气分析仪仪器包括一个产生激发光的蓝色受控光源，光纤与一个光电极相连，光电极受激发的光（荧光）从光纤送光电二极管检测，计算机根据二极管的检测量计算pH、pO2、pCO2，并在屏幕上显示它们的结果。采用光电极，便于批量生产，不需常校正，不工作时不消耗试剂，响应时间快，携带式仪器，便于急诊使用，且可在病人家中或边远地区提供服务。非侵入性测量技术：利用电极技术，经皮测量PO2，PCO2和PH值。脉搏式血氧计进行血氧饱和度的测量。用质谱仪对经皮肤扩散气体的测量。参数动脉血混合静脉血PCO25.32kPa6.18kPaPO213.3kPa5.32kPa经皮血气参数的测量血气PO2和PCO2反映血液中酸碱平衡状态。一般通过间断地采集动脉血样来完成血气测量。许多情况下，血气变化迅速，需要采用无创监测方法。日前常采用经皮方法：选择具有良好的组织灌注的皮肤部位。用一个扁平的双边胶圈将电化学传感器（电极）固定在体肤上，被测血气从真皮至表皮，与一层耦合液一起渗透到传感器。测量过程中，皮温要保持在33℃～35℃。低于，则皮肤内外的交换会受到扩散的限制；高于，则通透性会急剧增加。应采用不断加热方式，使皮肤保持一定通透性。经皮血气检测的关键是经皮血气传感器(电极)的开发，以及经皮血气监测方法的研究。

经皮血气监测仪经皮测量的原理电阻高含蛋白质，脂类，黑色素细胞毛细血管，分布密度1/mm2

经皮血气参数测量实验研究证明，采用电化学传感技术、质谱仪和气相色谱分析方法，均能有效地测量经皮氧分压tcPO2和经皮二氧化碳分压tcPCO2。这种经皮无创测量方法已在临床上用于心肺疾病患者的应急试验，用于麻醉病人监测、呼吸治疗处理、最佳截肢位置估计、移植皮瓣存活力预测，以及一些药物疗效评估。经皮PO2电极加热极谱法PO2电极；阴极是铂或者金制成；阳极是表层涂有银氯化物的银环；电解质是氯化钾缓冲剂；3.3电解质分析仪

电解质测定体液分为电解质和非电解质，电解质常指K,Na,Cl,C