原生质体融合(实验报告)

PAGE1-酵母原生质体融合××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。原生质体融合育种(protoplastfusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟,一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。细胞融合之后，还经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。因此，必须经过多次分离纯化才能够获得稳定的融合子。本实验将通过酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70的融合，以期获得具有更高发酵效率的酿酒酵母新品种并应用于制酒工业，在节省酿酒粮食的投入量前提下提高发酵产量。以期获得更好的经济价值。材料与方法1.1材料酿酒酵母2.339；酿酒酵母2.701.2培养基和试剂1.马铃薯培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml.2.YEPD培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000g，PH6.03.YEPD高渗培养基：在YEPD培养基中加入0.6mol/L，3%琼脂。4.YNB高渗基本培养基：YNB基本培养基中0.6mol/LNaCl5.生理盐水（0.85%）6.0.6mol/LNaCl7.无菌水8.其它化学试剂均为国产分析纯。1.3实验用具试管、三角瓶、摇床、恒温培养箱、恒温水浴锅、离心机、接种环、移液管、酒精灯、分光光度计1.4方法1.4.1原生质体的制备①收集菌体从斜面上取两亲本菌株各一环酵母菌分别接种于5ml含有YEPD培养基的试管中，25℃静置培养24后，0.3-0.5ml，转接至装有50新鲜YEPD培养基的250三角瓶中，摇床25℃培养至对数早期（14-16h），细胞数达107-108/mL。离心（3000r/min，5min）收集菌体。②菌体的预处理菌体用生理盐水洗两次（3000r/min，5min），去上清液后，于离心管中加入预处理液（其用量约为每克湿重菌体用4mL处理液），25℃，30min，离心3000r/min），5min，取沉淀物。酶液处理去壁于上述离心管中加入新鲜配制的酶液5mL（酶液用量约为1%-2%），轻轻摇动，悬浮细胞，然后于30℃摇床轻轻震荡培养50min，每隔20min取样于相差显微镜下观察，绘图并计数原生质体的形成率（按下列公式计算）。待90%以上细胞都形成原生质体后，离心去除酶液，并用0.6mol/LNaCl洗涤1次，用10mL0.6mol/LNaCl将原生质体制成悬液，备用。原生质体形成率=原生质体数/（原生质体数+完整细胞数）×100%1.4.2原生质体的融合①加入助溶剂将双亲原生质体悬液（5×107-10×107个/mL）各3mL混合于8ml的离心管，离心（3000r/min，10min）弃上清后，加入3mL助融剂，轻轻震荡，悬浮原生质体并置25℃恒温水浴保温20min。每隔3-4min轻轻摇动一次，使助溶剂与原生质体充分接触，然后立即加入8mL高渗YEPD培养基，离心（6000r/min，10min），弃上清液可获得融合沉淀物（即原生质体融合物）。②稀释及涂布用0.6mol/LNaCl悬浮以上获得的原生质体融合物，并进行稀释至10-3，分别从10-2、10-3中取0.1mL，涂于YNB基本培养基平板上。③选择融合子及计算融合频率将以上培养物于25℃培养2d，从长出的菌落中选出融合子。另取等量稀释液用相同方法于再生完全培养基（YEPD高渗培养基）中培养后，并计算菌落数。融合频率=（融合子数×稀释倍数）/再生完全培养基上长出的总菌落数×稀释倍数1.4.3原生质体的再生将双亲原生质体悬液用0.6mol/LNaCl稀释至10-5，取0.2mL涂布于高渗YEPD培养基。对照用无菌水稀释原生质体，均匀涂布于YEPD培养基。25℃培养48h，分别记录长出的菌落数，计算原生质体的再生率。原生质体的再生率=（高渗YEPD长出的菌落数-YEPD长出的菌落数）/显微镜计数的原生质体数结果与分析2.1原生质体形成率用新鲜配制的去壁酶液5ml，轻轻摇动，悬浮细胞，然后于30℃摇床轻轻震荡培养50min，计数原生质体的形成率：原生质体形成率=原生质体数/（原生质体数+完整细胞数）×100%结果如表1所示。2.339和2.70两种菌株的原生质体的形成率分别为77.68%和96.51%，说明两种菌株的原生质体形成率相差不大。说明酶水解去壁取得了良好的效果。表1原生质体形成率结果类别数目原生质体数完整细胞数原生质体形成率2.3391.165×1099.05×10877.68%2.71.245×1091.29×10996.51%2.2原生质体再生将双亲原生质体悬液用0.6mol/LNaCl稀释至10-5，取稀释液涂布于高渗YEPD培养基。对照用无菌水稀释原生质体，均匀涂布于YEPD培养基。25℃培养48h，分别记录长出的菌落数，计算原生质体的再生率：原生质体的再生率=[（高渗YEPD长出的菌落数-YEPD长出的菌落数）/显微镜计数的原生质体数]×100%结果如表2所示。2.339由于菌株在平板上长得非常密集导致无法计数，使原生质体再生率无法计算。2.7菌株原生质体的再生率为75.2%，说明2.339菌株的原生质体再生率要更优于2.70菌株。表2原生质体的再生结果表酿酒酵母菌株YEPD长出的平均菌落数高渗YEPD长出的平均菌落数显微镜计数的原生质体数原生质体的再生率2.339无数44801.165×109无法计算2.70124218121.245×10945.78×10-62.3原生质体融合频率将双亲原生质体悬液混合于离心管，离心弃上清后，加入3mL助融剂，轻轻震荡，悬浮原生质体并置25℃恒温水浴保温20min。每隔3-4min轻轻摇动一次，然后立即加入高渗YEPD培养基，离心，弃上清液即得原生质体融合物：融合频率=[（融合子数×稀释倍数）/再生完全培养基上长出的总菌落数×稀释倍数]×100%融合结果如表3所示。两菌株融合后，稀释度为10-2的菌株原生质体融合频率为27.07%，稀释度为10-3的菌株原生质体融合频率为42.55%，说明稀释度为10-3的菌株原生质体融合频率更高。表3原生质体融合结果稀释倍数融合子数平均数再生完全培养基上长出的平均总菌落数融合频率稀释10-21440532027.07%稀释10-3868204042.55%讨论原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基础理论研究提供了一种重要工具,也为遗传育种提供了一种有效手段,已广泛应用于微生物育种工作的各个方面。近年来,灭活原生质体融合、离子束细胞融合、非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法相继提出并应用于微生物育种,这是原生质体融合技术的新发展。相信随着技术的不断完善,原生质体融合在生物育种中占有的地位会越来越重要。原生质体融合技术在生产实践中的应用产生的效益,已是举世瞩目,它已成为高新技术开发的重要领域。该技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制理念等领域的研究提供了有力的手段,而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值。通过原生质体融合进行细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。参考文献：[1]杜金华,