流式细胞仪应用

TheApplicationsofFlowCytometry内容流式细胞仪基本原理、应用流式细胞实验结果分析实验的注意事项流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量通过流式细胞仪我们可以得到以下信息

-相对细胞大小

-相对细胞颗粒密度和内部复杂度

-染色过细胞的相对荧光强度

流式细胞术的应用

细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量……

细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位

……流式细胞仪结构示意图液流系统光路系统电子系统数据系统细胞分选系统光信号如何收集？光学收集器是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，可将产生的不同波长光信号引导至不同的电子探测器。直接染色FluorescentprobeattachedtoantibodySpecificsignal:weakNonspecificbinding:low间接染色Fluorescentprobeattachedtoa2ndantibodySpecificsignal:strong,5-62ndAb/each1stAb;Nonspecificbinding:high光学滤片分光器光电探测器信号名称激发波长发射波长FCSSSCFL1FL2FL3FL4FITCPEPerPCAPC侧向前向488488488488488633525575667660488488(FACSCalibur型

)光路系统流式细胞仪的光信号散射光信号荧光信号散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信号

细胞相对大小及其表面积。侧向角散射（SSC,SideScatter）

入射激光90

角的散射光信号

细胞粒度及细胞内相对复杂性。前向角散射光——FSCFALS

SensorLaser侧向角散射光——SSCFALSSensor90LSSensorLaser散射光散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异

- 通常使用“散点图”来看散射光信号

- 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据散点图——DotPlotReviewQuestionDeadcellsareknowntobesmallerandtoexhibitmoreinternalcomplexitythanlivecells.Whichofthepopulationsonthisplotwouldyouexpecttobedead?AB荧光信号荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能，释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 流式图片如何解读？单参数直方图双参数散点图三维图坐标类型：线性放大坐标，对数放大坐标流式图片如何解读？单参数直方图横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量2倍体异倍体4倍体肿瘤组织中的各种DNA倍体双参数二维点图三维图Pseudo3DPlot3DPlot流式得到的数据如何分析？BDCalibur:cellquest软件BDcantoII，Aria,LSR：DIVA软件不同品牌，不同类型流式细胞仪使用的分析软件不同。流式细胞仪同一数据标准为FSC文件（国际流式协会制定）由斯坦福大学设计研发的一款非常强大的流式数据分析软件---------FlowJo软件阴性对照组和CD3FITC/CD19PE双染样本散点图象限界定下图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19PE），右下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。流式得到的数据如何分析？流式得到的数据如何分析？有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来流式得到的数据如何分析？高FL细胞与低FL细胞区分开来这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高流式几个重要概念门：用于分析样本内的指定细胞同型对照

------除去荧光抗体的特异性决定位点，是真正意思上的阴性对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色

流式几个重要概念例：一个双色染色的实验抗体AFITC，抗体BPE

对应的同型对照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1FITC,IgG1PE单阳性对照：

FITC:细胞加上AbAFITC,IgG1PEPE:细胞加上AbBPE,IgG1FITC流式几个重要概念亦可在封闭是加入一抗来源的免疫球蛋白阴性对照cellonly流式几个重要概念抗体染色一般方法外周血白细胞分析：100ul全血血小板分析：1-5ul全血（根据样本血小板数量）红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使用）骨髓：20ul其他样本，计数后决定使用体积目标细胞数量及检测终浓度：1×106/ml孵育、溶血、固定抗体孵育：下避光20分钟（某些情况下如：细胞内因子检测需冰育）固定：1%paraformaldehyde200ul重悬20min流式检测对象要求？目标物可以是细胞、细菌或各种微粒0.5um~50um范围内动物标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。以及血清或各类体液样本。Flowcytometryofapoptoticcelldeath凋亡细胞检测方法一凋亡细胞检测方法一凋亡细胞检测方法二DNA链的断裂细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200bp的DNA片段。断裂的末端可以通过末端转脱氧核苷酰酶(TdT)连接上dUTP。Br-dUTP（三磷酸溴脱氧尿苷）链接DNA断裂点检测凋亡凋亡细胞检测方法二凋亡细胞检测方法三细胞DNA含量

在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。