《大学化学教学》12 分光光度法

仪器

可见分光光度计1整理课件2整理课件

第十二章可见分光光度法和

分光光度法是根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、定量分析的一种分析方法。分光光度法可见分光光度法（380-780nm）紫外分光光度法（10-380nm）（常用200-380nm）红外分光光度法（780nm-3

105nm）重要特点：灵敏度高，适用于微量和痕量分析。相对误差一般为2%—5%。紫外分光光度法3整理课件教学要求1.了解分光光度法的特点、原理和基本概念。

2.掌握Lambert-Beer定律的数学表达式，能熟练利用该式进行有关计算。3.了解分光光度法测定条件的选择。4.了解分光光度法的误差来源。5.掌握吸收曲线和标准曲线的绘制方法及其应用。6.掌握分光光度法的有关应用。7.熟悉分光光度计的主要组成部件及其作用。4整理课件§12.1物质的吸收光谱一、物质对光的选择性吸收

当一束光照射到某物质或某溶液时，组成该物质的分子、原子或离子等粒子接受光的能量，使这些粒子中的电子由低能量的轨道跃迁到高能量轨道，也就是说：由基态转变为激发态。M（基态）+hνM*（激发态）这个过程就是物质对光的吸收。

由于分子、离子或原子的能级是量子化的，只有光子的能量（hν）与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差（ΔE）相等时，才能被吸收。5整理课件单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿单色光、复合光、光的互补6整理课件完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意物质的颜色与光的关系表观现象示意复合光物质对光的吸收7整理课件二、物质的吸收光谱测量该溶液对不同波长(λ)的单色光的吸收程度，即吸光度A（absorbance）。

以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，可得一条曲线，即为吸收光谱或称为吸收曲线。不同波长(λ)的单色光依次通过有色溶液波长λ1λ2λ3λ4吸光度A1A2A3A4图12-2三（邻二氮菲）合铁（）离子的吸收光谱8整理课件

吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波长，用“

λmax

”表示。

若在最大吸收波长处测定吸光度，灵敏度最高。λmax是定性分析的依据；而溶液的浓度越大，吸光度A越大，是进行定量分析的依据。

图中λmax为508nm，说明溶液最容易吸收的波长为508nm附近的光（绿色），所以溶液呈现绿色光的补色-紫红色。9整理课件§12-2分光光度法基本原理一、透光率和吸光度均匀的有色溶液单色光IoIaItIr为反射光强度I0=Ia+It+Ir空白溶液被测溶液I0=Ia+It

加空白消除影响，上式可简化为：Io为入射光强度Ia为吸收光强度It为透过光强度10整理课件

透射光的强度It与入射光的强度I0之比称为透光率（transmittance）用符号“T”表示T

越大，溶液对光的吸收就越少；T

越小，溶液对光的吸收就越多。透光率的负对数称为吸光度，用符号“A”表示。A越大，溶液对光的吸收就越多。11整理课件二、Lambert-Beer定律

Lambert定律：当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其吸光度与液层厚度成正比。A=k1b式中：b为液层厚度；

k1为比例系数。

Beer定律：当一适当波长的单色光通过一液层厚度固定的溶液时，其吸光度与溶液的浓度成正比。A=k2c式中：C为物质的量浓度或质量浓度；k2为比例系数。12整理课件将以上两式合并得：A=εbc（Lambert-Beer定律数学表达式）

式中：b的单位为cm；c为物质的量浓度（mol/L）；

ε为摩尔吸光系数，单位为L·mol-1·cm-1。

若用质量浓度（g·L-1）代替物质的量浓度c，Lambert-Beer定律可表示为：A=ab

式中：a为质量吸光系数，单位为L·g-1·cm-1。a和ε可以相互换算：εbc=ab

εc=a

ε=a×/c=aM13整理课件

比吸光系数：是指100mL溶液中含被测物质1g，液层厚度b为1cm时的吸光系数值，用表示。

如果溶液中同时存在两种或两种以上对光有吸收的物质，在同一波长下只要共存物质不相互影响，也就是说，不因共存物的存在而改变本身的吸光系数，则总吸光度是各共存物的吸光度之和。A=Aa+Ab+Ac+····14整理课件

例12-1已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmol/L的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池，测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数ε及质量吸光系数a。解：有Lambert-Beer定律可得：已知：c=0.150×10-3mol/L，b=2.00cm，T=0.39815整理课件例12-2测试酶与腺苷酸（AMP）体系的吸光度如下：

A（280nm）

=0.46，A（260nm）=0.58

试计算每一组分的浓度？已知：酶的ε（280nm）=2.96×104L·mol-1·cm-1ε（260nm）=1.52×104L·mol-1·cm-1AMP的ε（280nm）=2.4×103L·mol-1·cm-1ε（260nm）=1.5×104L·mol-1·cm-1吸收池厚度为1.00cm。16整理课件

解：设酶和腺苷酸（AMP）的浓度分别为y和z，因吸收光的加和性λ为260nm0.58=1.52×104L·mol-1·cm-1×1.00cm×y+1.5×104L·mol-1·cm-1×1.00cm×zλ为280nm0.46=2.96×104L·mol-1·cm-1×1.00cm×y+2.4×103L·mol-1·cm-1×1.00cm×z解方程组得：y=1.4×105mol/L；（酶的浓度）

z=2.5×105mol/L（AMP的浓度）17整理课件0.575光源单色器吸收池检测器显示光谱法仪器——分光光度计基本组成部分：辐射源/光源(source)单色器(monochromator)检测器(detector)§12.3可见分光光度法18整理课件标准曲线法(校准曲线，工作曲线法，外标法）01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx标准系列未知样品二、测定方法19整理课件标准对照法未知样品标准样品20整理课件（三）比吸光系数比较法

比