食品中蛋白质和氨基酸的测定（食品分析课件）

4.6.1食品中的蛋白质

及其测定意义蛋白质概况蛋白质的测定意义生命的物质基础食品中蛋白质含量的多少关系着人体的健康蛋白质是食品最重要的质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味蛋白质的性质两性水解反应胶体性质盐析变性颜色反应气味反应蛋白质的测定方法蛋白质的测定利用蛋白质的共性利用蛋白质的官能团]4.6.2凯氏定氮法

——蛋白质系数不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同来源的蛋白质其含氮量是不一样的。=N%×6.25=蛋白质含量F4.6.3凯氏定氮法凯氏定氮法是由丹麦化学家凯道尔于1833年建立的，现已发展为常量、微量、平微量凯氏定氮法以及自动定氮仪法等，是分析有机化合物含氮量的常用方法。实验原理1.消化：2NH3+H2SO4+2H+

(NH4)2SO42.蒸馏：(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO4

2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O3.滴定：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3

实验试剂浓硫酸混合催化剂CuSO4/K2SO4=0.4/6混合指示剂0.1%甲基红乙醇溶液200ml与0.1%甲烯蓝乙醇溶液50ml混合NaOH40%硼酸溶液2%盐酸标准溶液0.01

N实验步骤——消化称取样品,移入消化管,加入混合催化剂,硫酸和两颗玻璃珠消化初期，电压150V，消化管内泡沫消失后，增加电压至220

V继续消化，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下消化管放冷，小心加蒸馏水至50ml，混匀备用。参照蒸馏装置图，装好蒸馏装置向接收瓶内加入20ml2%硼酸溶液及混合指示液2滴，并使冷凝管的下端插入液面下吸取l样品消化稀释液由小漏斗流入反应室，并以5ml水洗涤小烧杯使流入反应室内。将10ml40%氢氧化钠溶液经小漏斗缓缓流入反应室，立即加半漏斗水水封以防漏气，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，从指示剂开始变色时计时，蒸馏5min。移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。实验步骤——蒸馏蛋白质测定蒸馏过程装置实验步骤——滴定用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N盐酸标准溶液滴定至淡紫红色为滴定终点。

式中：ω——蛋白质的质量分数；

c——HCl标准溶液的浓度；

V1——滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积；V2——滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积；

m——样品质量，g；

M——氮的摩尔质量，14.01g／mol；

F——氮换算为蛋白质的系数。实验结果处理4.6.4双缩脲法测蛋白质含量测定蛋白质的方法物理性质紫外分光光度法化学性质凯氏定氮法双缩脲法Lowry法染色性质考马斯亮蓝法银染法其他性质免疫比浊法双缩脲法——原理1.双缩脲的制备NH2—CO—NH2

+NH2—CO—NH2

NH2—CO—NH—CO—NH2+NH32.双缩脲反应具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质分子中含有肽键—CO—NH—与双缩脲结构相似。因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。双缩脲法——试剂①双缩脲试剂取1.5g硫酸铜和6.0g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中,搅拌加入300mL的10％NaOH（可另加

1

gKI以防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水稀释至l000mL。②标准蛋白溶液用0.05mol/L氢氧化钠溶液作溶剂，配制10mg/ml酪蛋白溶液。③待测蛋白质溶液测定血清等样品时需做适当稀释，使其浓度在标准曲线测试范围内。1.标准曲线的绘制取6支干燥洁净比色管编号，按下表加入下列试剂：采用标准曲线法，即A540(540nm吸光度值)为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

加入物（ml）

012345标准蛋白液/ml00.20.40.60.81.0蛋白浓度/(mg/ml)

02.04.06.08.010.0蒸馏水/ml

1.00.80.60.40.20.0双缩脲试剂/ml

4.04.04.04.04.04.0充分混匀后，室温下（20—25℃）放置30min

A540

双缩脲法——操作步骤2．样品测定取2支试管，加入待测样品液各1mL，加入双缩脲试剂4mL，室温下（20—25℃）放置30min，用分光光度计测定吸光度。3.结果计算将测得的吸光度代入标准曲线的回归方程，求得未知样品的蛋白质浓度。以mg/mL计。

注意事项1．本实验方法测定范围1－10mg/ml蛋白质。2．各管由显色到比色的时间应尽可能一致。3．有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。4.双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。5.双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱，如氢氧化钠所代替。向试剂中加入碘化钾，可延长试剂的使用寿命。4.6.3食品中的氨基酸

及其测定氨基酸的结构氨基酸分子通式氨基酸的作用药用食品加工生理调节作用物质基础氨基酸的测定方法甲醛滴定法电位滴定法茚三酮比色法非水溶液滴定法邻苯二甲醛法三硝基苯磺酸法乙酰丙酮法双指示剂甲醛滴定法——原理试剂配制方法0.1％百里酚酞乙醇溶液溶解0.10g百里香酚蓝于2.2ml氢氧化钠溶液（4g/L）和5ml95%乙醇中，稀释至100ml。0.100N氢氧化钠标准溶液的配制剂标定标定基准邻苯二甲酸氢钾标定NaOH标准溶液的浓度20％(W%)中性甲醛溶液甲醛稀释至20%浓度后，以百里酚酞为指示剂，用0.1NNaOH溶液滴定呈淡蓝色。0.1％中性红(50％乙醇)溶液0.1克中性红溶于50mL95%乙醇中,蒸馏水定容至100mL。双指示剂甲醛滴定法——试剂1份加入3滴中性红指示剂

用0.100mol/LNaOH标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点

另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml,摇匀静置反应1min根据两者耗碱液体积之差可求出氨基酸含量用0.100mol／LNaoH标准溶液滴定至淡蓝色为终点移取含氨基酸态氮约20－30mg的样品溶液2份，分别置于锥形瓶中，各加适量蒸馏水中和游离酸中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质样品含氨基酸态氮约为0.4g/100mL甲醛滴定法步骤双指示剂甲醛滴定法——结果计算①此法适用于测定食品中的游离氨基酸②固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在50℃水浴中进行0.5h即可。③若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。④与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和—COOH时的pH为8.5~9.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。甲醛滴定法——注意事项根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成原电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH判断滴定终点。电位滴定法——原理吸取含氨基酸样液于容量瓶中，加水定容，混匀吸取适量置于烧杯中，加水适量，开动磁力搅拌器用NaoH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数加入甲醛溶液，混匀用同样氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2记录消耗氢氧化钠标推溶液毫升数电位滴定法——操作步骤空白实验：取蒸馏水置于洁净烧杯中，先用氢氧化鈉标准溶液调至pH8.2，再加入中性甲醛溶液，用氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，作为试剂空白试验。结果计算：

氨基酸态氮含量=式中：V1——样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mLV2——空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mLc——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L

电位滴定法——结果计算①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定②浑浊和色深样液可不经处理而直接测定电位滴定法——注意事项茚三酮比色法——原理①标准曲线绘制：取7个洁净干燥的25mL比色管，按照下表所列数值配制溶液，于水浴上加热15min，取出迅速冷却至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。②样品测定：吸取澄清的样品溶液1～4mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，测得的A值在标准曲线上可查得对应的氨基酸质量。1234567氨基酸标准溶液0.0mL0.5mL1.0mL1.5mL2.0mL2.5mL3.0mL蒸馏水4.0mL3.5mL3.0mL2.5mL2.0mL1.5mL1.0mL茚三酮1.0mL1.0mL1.0mL1.0mL1.0mL1.0mL1.0mL磷酸盐缓冲溶液1.0mL1.0mL1.0mL1.0mL1.0mL1.0mL1.0mL茚三酮比色法——操作步骤结果计算：

氨基酸含量=（mg/100g）式中：m——从标准曲线上查得的氨基酸的含量，μgm1——测定的样品溶液相当于样品的质量，g茚三酮比色法——结果计算①通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品5～10g或吸取样液样品5