蛋白质的研究进展

蛋白质组学研究进展蛋白质组学研究进展一、蛋白质组学的产生与发展二、蛋白质组学的相关概念三、蛋白质组学研究方法概述四、蛋白质组学在肿瘤研究中的应用人类基因组计划（HGP）1986年，达尔贝科提出人类基因组计划1990年，美国国会批准“HGP”，9月，中国获准加入，负责测定人类基因组序列的1%2000年6月26日，草图绘制成功2003年4月14日，人类基因组序列图绘制成功蛋白质组学产生的背景改变花色的转基因矮牵牛花转入荧光素酶蛋白基因的发荧光烟草蓝色玫瑰蛋白质组学发展历史1994年，澳大利亚科学家Wilkins等人首次提出蛋白质组概念1996年，澳大利亚建立了第1个蛋白质组研究中心（APAF）2001年4月，美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（HUPO）20世纪90年代中期，蛋白质组学以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：美国国家癌症研究院（NationalCancerInstitute）和食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration）共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。2003年12月15日，国际人类蛋白质组组织负责人在北京宣布，国际人类蛋白质组计划正式启动，“人类肝脏蛋白质组计划”和“人类血浆蛋白质组计划”两大项目首先开始执行，其中“人类肝脏蛋白质组计划”由中国科学家领导执行，这是我国科学家第一次领导执行重大国际科技协作计划。

首次由我国科学家领导的国际重大科研合作项目——人类肝脏蛋白质组计划，被宣告取得阶段性新进展。几年来围绕人类肝脏蛋白质组的表达谱、修饰谱及其相互作用的连锁图等九大科研任务，我国科学家已经成功测定出6788个高可信度的中国成人肝脏蛋白质，系统构建了国际上第一张人类器官蛋白质组“蓝图”；发现了包含1000余个“蛋白质-蛋白质”相互作用的网络图；建立了2000余株蛋白质抗体。蛋白质组学研究进展一、蛋白质组学的产生与发展二、蛋白质组学的相关概念三、蛋白质组学研究方法概述四、蛋白质组学在肿瘤研究中的应用蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,意指proteinsexpressedbyagenome，即“一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质”。

蛋白质组学的概念对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组是：蛋白质组学是什么样的一门科学？

指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。

主要研究内容了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。蛋白质组学研究进展一、蛋白质组学的产生与发展二、蛋白质组学的相关概念三、蛋白质组学研究方法概述四、蛋白质组学在肿瘤研究中的应用蛋白质组研究更为复杂和困难：蛋白质数目大大超过基因数目蛋白质随时间和空间而变化当前主要任务：发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分析鉴定蛋白质组学研究的生物信息学定量蛋白质组学研究二、蛋白质组功能模式的研究方法蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质相互作用研究技术研究蛋白质组的组成成分

支撑技术主要有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学分析。

蛋白质组表达模式（expressionprofile）：蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分析鉴定蛋白质组学研究的生物信息学定量蛋白质组学研究二、蛋白质组功能模式的研究方法蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质相互作用研究技术（一）蛋白质组研究中的样品制备

通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。样品预分级的主要方法蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。组织水平上的蛋白质组样品制备临床样本都是由多种细胞或组织混合而成，如肿瘤中癌变上皮细胞总是与血管、间质细胞等混杂一起。

激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。

LCM具有其独特的优点快速简单、有效减少交叉污染。样品的切割与分离由激光一步完成，并可以保持被分离的样品的完整性。结合免疫荧光能够基于组织细胞的表型和功能特征进行分离样品组分。对制样的要求灵活多样，使用范围较广。通过LCM对组织切片进行切割与分离可以分离收集从形态上（普通染色），表型或功能上（荧光染色）可以辨认均一性的细胞群体，从而克服了组织不均一的特点，提高了数据的准确性和可靠性，这在肿瘤生物学研究中具有广泛应用。

蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分析鉴定蛋白质组学研究的生物信息学定量蛋白质组学研究二、蛋白质组功能模式的研究方法蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质相互作用研究技术（二）蛋白质组研究中的样品分离双向凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。原理第1向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，具有相同等电点的蛋白质无论其分子大小，在电场的作用下都会用聚焦在某一特定位置即等电点处；第2向则按分子量的不同用SDS分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。第一向分离等电聚焦蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。第二向分离SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS．PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质．SDS复合物，由于SDS是一种强阴离子去垢剂．所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响．而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系，在蛋白质组研究中。需要在同样的条件下同时走多块胶，这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要。特点可分离10～100kD分子量的蛋白质高灵敏度和高分辨率便于计算机进行图像分析处理与质谱分析匹配双向凝胶电泳(2-DE)技术的缺点极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。

胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。新型非凝胶技术

液相色谱法

liquidchromatography，LC毛细管电泳法

capillaryelectrophoresis，CE液相色谱-质谱联用技术（LPLC-MS/MS）

蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。

根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。离子交换色谱是通过溶质在离子交换色谱固定相上具有不同的保留能力，而实现样品分离的色谱技术，而反相液相色谱是基于溶质疏水性的差异而实现分离的色谱技术。通过这两种色谱模式的联用，可以实现对复杂生物样品的二维分离。

多维色谱技术（LC/LC-MS/MS）

多维蛋白质鉴定技术(multidimensionalproteinidentificationtechnology)将不同分离模式的色谱柱以串联方式合并于同一根色谱柱中进行，在同一根色谱柱的前半部分装填强阳离子色谱填料，后部分装填反相液相色谱填料，该方法可对样品量较少的蛋白质进行快速分析。

蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分析鉴定蛋白质组学研究的生物信息学定量蛋白质组学研究二、蛋白质组功能模式的研究方法蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质相互作用研究技术（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定传统方法：Edman降解法:Edman降解（Edmandegradation）：是测定蛋白质一级结构的方法，主要是从蛋白质或多肽氨基末端进行分析。由埃德曼（P．Edman）在上世纪50年代所创立。分为耦合、切割、萃取、转化、鉴定等几个步骤。首先在pH9.0的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)处理耦合后产物，将多肽或蛋白的N一端第一个肽键选择性的切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物；随后萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最后以色谱法鉴定出降解下来的PTH-氨基酸种类，从而得到蛋白质或多肽N端序列信息。Edman降解法的优点是异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应产率和回收率都相当高，因此反应副产物少，用色谱可以准确鉴定。蛋白质序列分析鉴定蛋白质

一些传统蛋白质分析技术如蛋白质序列分析技术（Edman降解法,1950），仍然可用于当前蛋白质组研究。其缺点是难于实现高通量，同时对低丰度蛋白质的鉴定上其灵敏度难于达到要求。

A-R-G-F-L-E-K-L

(得到部分序列)491蛋白质微量序列仪印渍转移酶解提取肽混合物毛细管HPLC仪收集肽于PVDF膜

PVDF膜通过Edman降解对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线

双向电泳分离新型蛋白质鉴定技术

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质谱（MS）法基本原理：质谱法(MassSpectrometry,MS)即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片，有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子－分子相互作用产生的离子）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成。样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。

MAIDI-TOFESI-MS/MS

酶解脱盐浓缩飞行时间质谱仪电喷雾串联质谱仪毛细管HPLC仪点样板序列标签(PST)数据库搜索双向电泳分离

蛋白质鉴定通过质谱对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线

肽肽质指纹（PMF）质谱技术鉴定蛋白质路线图基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）MALDI-TOF质谱仪：灵敏度高（可达fmol），分析速度快，谱图简单易于解析以及受缓冲液、盐份的干扰小电喷雾质谱（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）电喷雾质谱仪：灵敏度高,能与液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段联用主要质谱类型鉴定和注释蛋白质的路线

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱通过肽质谱指纹图（peptidemassfingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配

电喷雾质谱通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配

联合技术精确鉴定蛋白质

组织切片或印片原位质谱分析技术两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS）表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）

蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组研究中的样品制备蛋白质组研究中的样品分离蛋白质组研究中的样品分析鉴定蛋白质组学研究的生物信息学定量蛋白质组学研究二、蛋白质组功能模式的研究方法蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质相互作用研究技术（四）蛋白质组学研究的生物信息学应用

1、对双向电泳结果进行图像分析，识别差异表达的蛋白质斑点；构建双向凝胶电泳图谱。2、单独或综合运用质谱分析数据、氨基酸测序结果等查询数据库以鉴定蛋白质。3、构建蛋白质组数据库。蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。（http://www.expasy.ch/）目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbEST数据库。NRDB是由NCBI创建的，是NCBI的BLAST搜索程序的默认蛋白质序列数据库。该数据库由GenPept（由GenBank编码序列自动翻译而成数据库）、SWISS-PROT数据库、SPupdate（每周更新的SWISS-PROT数据库）、PIR（蛋白质信息资源）和GenPeptUpdate(每天更新的GenPept)数据库复合而成。因此该数据