mdr1基因多态性对度洛西汀稳态血药浓度的影响

mdr1基因多态性对度洛西汀稳态血药浓度的影响

根据近年来的药物遗传研究，遗传因素是药物代谢、转移和靶层受体的多态性，尤其是与药物代谢、手术和靶层受体相关的基因的多态性。可能是影响药物临床效果和副作用的主要因素。而药物治疗是抑郁症主要的治疗方法,其中度洛西汀是近年才在临床上推广使用的新型抗抑郁药物,且属于选择性5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂。研究显示,该药是P-糖蛋白的一个底物,可被P-糖蛋白从中枢系统主动泵出,从而使药物疗效降低。因此推测编码P-糖蛋白的多药耐药1(multidrugresistance1,MDR1)基因多态性可能影响度洛西汀的代谢与抗抑郁疗效。已有相关研究表明人群中变异频率较高的两个MDR1基因位点G2677T和C3435T多态性与帕罗西汀抗抑郁疗效无关,但与度洛西汀疗效的关系尚未明确。故本研究拟在抑郁症患者中探讨MDR1基因的G2677T和C3435T多态性对度洛西汀稳态血药浓度和临床疗效的影响。1对象和方法1.1分组和排除标准均来自于2009年4月至2010年3月广州市精神病医院的抑郁症门诊患者,入组标准:(1)符合中国精神障碍分类与诊断标准第3版(CCMD-3)抑郁发作标准;(2)首次发作,24项汉密尔顿抑郁量表(24-itemHamiltondepressionratingscale,HAMD-24)总分≥20分;(3)入组前1~2周内未接受抗精神病药物治疗并未服用过CYP2D6抑制或诱导剂,6周内未服用抗精神病缓释制剂;(4)血尿常规、肝肾功能、心电图等均正常。排除标准:(1)入组前已使用过抗抑郁药;(2)合并明显的躯体疾病、神经系统疾病和其他精神障碍;(3)嗜烟嗜酒;(4)肝肾代谢功能异常;(5)滥用精神药物;(6)孕妇或哺乳期妇女,因语言障碍不能按临床试验方案进行者。共入组患者131例,11例在入组后3周内逐渐脱落,其中4例因为胃肠道反应要求换药,4例不愿透露原因未继续来门诊接受药物治疗,3例不愿继续用度洛西汀治疗改用其他方案。最后入组120例患者,男性48例,女性72例,年龄为18~60岁,平均(37±4.5)岁,病程从3个月至12年,平均为(3.4±1.2)年。研究得到广州市精神病院医学伦理委员会批准,所有的受试者或其合法监护人均签署知情同意书。1.2方法1.2.1治疗前评估及疗效评估(1)治疗方法:所有患者均接受度洛西汀胶囊(商品名:欣百达,每粒60mg)足量治疗8周。起始量60mgqd,3周之内视耐受情况可调整治疗剂量,最大量120mg/d。必要时睡前用药统一选择为氯羟安定2~4mg/d(120例中97例患者使用)。(2)临床疗效评估:在入组时、治疗6周和8周后采用HAMD-24评估患者的病情,由第一作者本人完成评估。疗效判定:治疗后HAMD-24的减分率<25%为无效,≥25%为有效,≥50%为显效。1.2.2质谱条件的确定入组时、8周末采集患者静脉血10mL,EDTA抗凝,置于4℃保存。检测血药浓度的同时检查血常规、肝功能、心电图。应用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)统一分析血液中度洛西汀的浓度。样品处理:0.5mL血浆加入0.1mL0.1moL/L的NaOH溶液,振荡1min,加入5mL乙醚,漩涡振荡5min,取4mL上层清液,在常温下用氮气吹干,残渣用50uL流动相溶解。色谱条件:色谱柱为NUCLEODURC18(2.0mm×125mm,3μm),柱温50℃。流动相为水(甲酸:2.7mmoL/L;醋酸铵:10mmoL/L)-乙睛(53:47,v/v),流速0.16mL/min,进样量5μL。质谱条件:电离源为电喷雾电离源正源(ESI+),选择性的监测质荷比(M/Z)298(度洛西汀)、286(内标)带正电荷的准分子离子峰。毛细管电喷雾电压3.9kV,萃取锥孔电压1V,取样锥孔电压35V,电离源温度为130℃,去溶剂温度为200℃,去溶剂气流速为350L/h。度洛西汀血浆浓度在1~100ng/mL内与峰面积积分值线性关系良好,萃取回收率和方法回收率均大于80%,日内、日间相对标准差均小于15%。1.2.3pcr扩增和回复突变试验利用上述静脉血标本分离出白细胞,并抽提DNA。参考文献采用聚合酶链反应(PCR)]和限制性内切片段多态性(RFLP)方法分析MDR1基因G2677T和C3435T位点的多态性。引物均由上海invitrogen公司合成。G2677T位点的上游引物:5′TGCAGGCTATAGGTTCCAGGCT3′,下游引物:5′TTTAGTTTGACTCACCTTCCCG3′。PCR反应条件为:94℃2min,94℃1min,50℃1min,72℃1min,40个循环,最后再72℃延伸5min,4℃终止。PCR产物长度为224bp,将PCR产物5μL加入限制性内切酶BanI(中国大连Takara公司生产)0.5μL混匀,37℃温育4h,2%琼脂糖凝胶电泳分析产物。GG型的PCR产物两条链均含有限制性内切酶BanI的酶切位点,被切开为198bp和26bp两个片段;CT型只有一条链被切开,显示出224bp和198bp片段;TT型的两条链均没有酶切位点,仍为224bp片段。T3435C位点的上下游引物分别为:5′TGTTTTCAGCTGCTT-GATGG3′,5′AAGGCATGTATGTTGGCCTC3′。反应条件为:94℃2min,94℃1min,56℃1min,72℃1min,40个循环,最后再72℃延伸5min,4℃终止。PCR扩增产物长度为197bp,5μL产物中加入限制性内切酶Sau3AI(中国大连Takara公司生产)0.5μL,37℃温育4h,2%琼脂糖凝胶电泳分析产物。CC型PCR产物两条链均含有Sau3AI的酶切位点,被切开为158bp和39bp两个片段;CT型只有一条链被切开,显示197bp和158bp两条片段;TT型的产物没有酶切位点,仍为197bp片段。见图1。1.3berg平衡、疗效评价及统计学方法以SPSS13.0进行正态检验和统计分析,各基因位点是否符合Hardy-Weinberg平衡采用2检验;各基因型组间的计量资料比较用方差分析(两两比较采用LSD检验,若方差不齐采用GamesHowell检验),而疗效等级资料采用秩和检验分析(Kruskal-WallisH非参数检验)。检验水准α=0.05,双侧检验。2结果2.1基因型频率的确定患者MDR1基因G2677T和C3435T位点的基因型频率均符合HardyWeinberg平衡。见表1。2=2.43,P=0.30;2=3.58,P=2.2不同基因型患者的稳态血药浓度分布G2677T和C3435T位点的不同基因型患者组间服用度洛西汀剂量的差异均无统计学意义(F=0.96,P=0.38;F=1.15,P=0.35)。G2677位点中不同基因型患者组间的度洛西汀稳态血药浓度差异有统计学意义(F=8.08,P<0.01),TT基因型患者组均高于GG型和GT型患者组(P<0.01)。在C3435T位点分析中,不同基因型患者组间的度洛西汀稳态血药浓度差异有统计学意义(F=6.93,P<0.01),TT型患者组比CC型和CT型患者组高(P<0.05),见表1。2.3不同基因型患者组间的疗效差异在治疗第6、8周,对患者的疗效采用无效、有效和显效分级(秩次依次定义为1、2、3)评价,分析MDR1各基因型与疗效的相关性。结果表明,在G2677位点中,不同基因型患者组间第6、8周度洛西汀的疗效差异具有统计学意义(2=6.07,P=0.048;2=6.63,P=0.04),TT型患者组服用度洛西汀第6、8周的疗效评分秩次均较GG型患者组高(P=0.01,P=0.02);在C3435T位点中,不同基因型患者组间第6、8周度洛西汀的疗效差异具有统计学意义(2=7.70,P=0.02;2=6.36,P=0.04),TT型患者组在第6、8周的疗效评分平均秩次均较CC型患者组高(P=0.005,P=0.01),见表2。3mdr1基因多态性与患者临床疗效的关系MDR1基因中C3435T和G2677T位点在人群中变异频率较高。G2677T的变异影响了编码P-糖蛋白氨基酸序列的改变,即丙氨酸转变为丝氨酸,使P-糖蛋白的表达和功能发生改变。而C3435T位点发生同义突变,即突变发生在密码子的第三个碱基位置(wobble位),故该密码子突变未引起所编码氨基酸序列变化,但突变后所编码的P-糖蛋白在十二指肠的表达发生了变化,可影响P-糖蛋白底物的肠道吸收。本研究探讨了G2677T/C3435T多态性对度洛西汀的稳态血药浓度和临床疗效的影响。本研究结果显示,MDR1基因的G2677T和C3435T多态性的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡,两位点各基因型的分布频率与文献报道相近,说明患者样本的代表性良好。结果显示,两位点的TT基因型抑郁症患者均具有较高的度洛西汀稳态血药浓度和较好的疗效,表明MDR1基因的G2677T和C3435T多态性与度洛西汀的代谢和临床疗效相关,提示MDR1基因多态性遗传标记可能预测抑郁症药物疗效,作为个体化治疗方案的重要依据。有研究表明,MDR1基因中C3435T和G2677T位点多态性能引起膜上P-糖蛋白表达差异,而P-糖蛋白表达上调与胞内底物结合增加,发生构型改变从而促进抗抑郁药的中枢外排,妨碍药物吸收。这可能是本研究中各基因型患者组度洛西汀稳态血药浓度差异的原因之一。C3435T和G2677T位点TT基因型患者体内P-糖蛋白表达和功能活性较低,可能促进度洛西汀进入中枢系统发挥药效作用。亦有研究表明帕罗西汀抗抑郁疗效与G2677T和C3435T多态性不相关,研究结论差异的原因可能与各抗抑郁药与P-糖蛋白的结合形式不同有关。帕罗西汀可作为P-糖蛋白的抑制剂,能直接抑制P-糖蛋白的活性,而度洛西汀作为P-糖蛋白的一个底物,需依靠其转运作