油茶叶乙醇提取物抗氧化活性研究

油茶叶乙醇提取物抗氧化活性研究

根据现代病理学研究，自由基与许多疾病有关，如动脉粥样硬化、抗病性、糖尿病、体格检查、癌症等。抗氧化剂不仅能清除自由基,而且能抑制自由基的产生。目前由于一些合成抗氧化剂,如二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)被发现有不同程度的致癌等毒副作用,因而在美国和日本已停止使用。随着人们绿色环保消费意识的增强,天然植物抗氧化剂日益成为研究的热点,广泛应用于食品、医药保健品和化妆品等行业。天然植物抗氧化剂广泛存在于油料、大多数辛香料和部分中草药中。油茶(CamelliaoleiferaAbel)是我国独有的一种食用油料木本植物,具有栽培历史悠久、分布区域广、栽培面积大、用途多等特点。但油茶叶资源并未得到利用,在油茶的整形修剪、低产油茶林的改造等过程中,大量的油茶叶常常被作为废弃物,极大地浪费了资源。研究发现,油茶叶中含有多种黄酮类化合物,具有良好的抗油脂氧化性能和治疗无名肿毒、犬咬及火烧成疮等生理活性,但是对油茶叶提取物清除自由基性能的研究未见文献报道。二苯基苦基肼自由基(DPPH·)是一种很稳定的含氮自由基,在乙醇溶液中呈典型的紫色,在327和517nm处有最大吸收峰,当有自由基清除剂存在时其颜色减退,褪色程度与清除剂的清除能力及数量呈定量关系。因此,可用分光光度法进行定量分析,从而评价抗氧化物质的抗氧化能力。DPPH·分光光度法具有稳定性好,简便易行,灵敏可靠,不需要昂贵的仪器设备等优点。作者首次对油茶叶乙醇提取物进行清除DPPH·能力的测定,希望能为油茶叶功能产品的开发和油茶资源的进一步综合利用提供理论依据。1材料和方法1.1制备粒径小的粉末油茶鲜叶于2006年12月采自中南林业科技大学株洲校区实习基地,经水洗沥干后,于(50±1)℃烘箱中烘干,粉碎成粒径约0.6mm的粉末(过24目筛),贮存于棕色试剂瓶中备用。1.2实验仪器与设备仪器:101A-3B型电热恒温鼓风干燥箱,上海实验仪器厂有限公司;FW100型高速万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司;AUY220型电子分析天平,岛津(香港)有限公司;R201C型旋转蒸发仪,郑州长城科工贸有限公司;UV-1100型紫外可见分光光度计,北京瑞利分析仪器公司;DZF-6050型真空干燥箱,上海精密实验设备有限公司。试剂:DPPH·,美国SigmaAldrich公司产品;芦丁,生化试剂;BHT,食品级;聚酰胺,粒径0.51～1.1mm,柱层析用;氯仿、95%(体积分数,下同)乙醇、无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为国产分析纯。1.3实验方法1.3.1乙醇提取物的制备准确称取一定质量的油茶叶粉,按料液比1∶15(g∶mL)加入体积分数60%的乙醇溶液,在水浴温度85℃下回流浸提1h,共浸提2次,合并浸提液。浸提液经浓缩、CHCl3萃取、醇沉、过滤后,将滤液浓缩成膏状,其中一部分直接真空干燥得乙醇提取物粗品,一部分用蒸馏水溶解配成一定浓度的溶液,经聚酰胺柱吸附,70%乙醇水溶液洗脱,洗脱液经浓缩、真空干燥得乙醇提取物精制产品。总黄酮质量分数测定按照文献进行,乙醇提取物粗品中总黄酮质量分数为12.48%,精制产品中总黄酮质量分数提高到24.04%。1.3.2dpph标准品溶液的配制准确称取DPPH·试剂0.2530g于小烧杯中,用95%乙醇溶解,定量移入1000mL容量瓶中,用95%乙醇稀释至刻度,摇匀,得253.0mg/LDPPH·贮备液,置于冰箱中冷藏备用。准确移取10.0mL上述DPPH·贮备液至100mL容量瓶中,用95%乙醇稀释至刻度,摇匀,得25.3mg/LDPPH·标准溶液。用吸量管分别加入25.3mg/L的DPPH·标准溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0mL于6个10mL容量瓶中,用95%乙醇稀释至刻度,摇匀,以95%的乙醇溶剂为参比,在一定波长处测定各溶液的吸光度。以DPPH·质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。1.3.3清除dpph能力测定方法主要参考文献的方法进行。将DPPH·贮备液稀释至25.3mg/L,分别在5.00mLDPPH·溶液中加入不同体积的抗氧化剂溶液,用95%乙醇稀释至总体积为6.00mL,混匀放置40min后,用1cm比色皿于517nm处测定吸光度,根据DPPH·标准曲线的回归方程计算DPPH·质量浓度,并按下列公式计算DPPH·清除率(y)。y=(1-ct/c0)×100%式中:c0—0时刻反应体系中DPPH·的起始质量浓度,mg/L;ct—t时刻反应体系中DPPH·的质量浓度,mg/L。2结果与讨论2.1扫描波长的测定将DPPH·乙醇溶液和分别加有少量芦丁、BHT、油茶叶乙醇提取物的DPPH·乙醇溶液在280～680nm波长范围内进行扫描测定,结果如图1所示。从图1可知,DPPH·在327和517nm处都有强吸收峰,加入少量芦丁、BHT、油茶叶乙醇提取物后,这2个峰值都有降低,而517nm处的峰值降低较显著,因此选取517nm作为测定波长,以提高测定灵敏度。2.2质量浓度测定按照1.3.2节的实验方法配制DPPH·标准溶液系列,并于517nm处测定其吸光度,以吸光度(A)对质量浓度(c)作图,得线性回归方程为A=0.0027+0.03376c,相关系数R=0.99994,在DPPH·质量浓度为2.53～25.3mg/L范围内线性关系良好。2.3抗氧化活性的测定不同的抗氧化剂对自由基的清除速率和清除效果是不相同的,通过测定517nm处溶液吸光度的变化可以动态监测其对DPPH·的清除作用情况。为了确定油茶叶提取物、芦丁、BHT对DPPH·的清除速率和反应时间,分别在DPPH·乙醇溶液中加入0.1mL质量浓度为0.5g/L的油茶叶粗提物、芦丁和BHT的乙醇溶液,每隔3～5min测定溶液的吸光度,直到吸光度基本稳定。吸光度随时间的变化规律如图2所示。从图2可知,在加入抗氧化剂的开始几分钟内,吸光度下降比较快,随着时间的增加,吸光度的下降趋势逐渐趋于平缓,最后达到基本稳定。其中油茶叶粗提物对DPPH·的清除速率最快(即达平衡的时间最短),在反应25min后吸光度基本稳定,芦丁对DPPH·的清除速率次之,35min后反应达到平衡,BHT的清除速率最慢,需40min反应才完成。因此在测定油茶叶乙醇提取物、芦丁、BHT对DPPH·的清除率时,选择与DPPH·反应40min后开始测定吸光度。2.4清除dpph能力的测定配制质量浓度为0.1g/L的油茶叶粗提物、油茶叶精提物、芦丁乙醇溶液和0.5g/LBHT乙醇溶液,根据1.3.3节的测定方法,分别在5.00mLDPPH·溶液中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0mL上述抗氧化剂溶液,用95%乙醇补充至总体积为6.00mL,测定其吸光度,计算各种不同质量浓度抗氧化剂的清除率,以清除率对抗氧化剂质量浓度作图,得到不同抗氧化剂的清除率曲线,如图3所示。从图3可知,油茶叶粗提物、油茶叶精提物、芦丁和BHT对DPPH·均具有一定的清除作用,且清除率随着各种抗氧化剂质量浓度的增大而增大,但当抗氧化剂质量浓度达到一定值时,清除率的变化趋于平缓,油茶叶精提物对DPPH·的清除率可达到88%以上。同时从图3还可以看出,在一定质量浓度范围内,DPPH·的清除率(y)与各种抗氧化剂的质量浓度(c)呈近似线性关系,各线性方程如表1所示。2.5油茶叶精提物与芦丁、blt的ec50值的比较为了评价抗氧化剂的抗氧化性能和自由基清除能力,常选择清除率为50%时抗氧化剂的质量浓度(EC50)作为评价指标,EC50值越小,抗氧化剂清除自由基能力越强。根据清除率与抗氧化剂质量浓度之间的线性关系,计算出油茶叶粗提物、精提物、芦丁、BHT的EC50值分别为12.19、6.765、9.481和37.53mg/L,显然其中油茶叶精提物对DPPH·的清除能力最强,BHT对DPPH·的清除能力最弱,它们清除DPPH·能力的大小顺序为:油茶叶精提物>芦丁>油茶叶粗提物≫BHT。油茶叶乙醇粗提物经聚酰胺柱层析纯化后,总黄酮质量分数由12.48%提高到24.04%,清除DPPH·的EC50值则由12.19mg/L降低到6.765mg/L,说明油茶叶乙醇提取物中的黄酮类化合物对DPPH·具有明显的清除作用。同时,总黄酮质量分数为24.04%的油茶叶乙醇提取物对DPPH·的清除能力比芦丁还强,可能是油茶叶乙醇提取物中含有比芦丁对DPPH·清除能力更强的其它化合物,这些化合物的结构有待进一步确定。3油茶叶乙醇提取物对dpph的清除作用3.1二苯基苦基肼自由基(DPPH·)法可以用于油茶叶乙醇提取物抗氧化能力的测定,测定波长为517nm,反应时间为40min。3.2油茶叶乙醇提取物对DPPH·具有明显的清除作用,且随着油茶叶乙醇提取物纯化程度的提高,其清除能力也相应地增强,油茶叶精提物对DPP