秦岭太白山区放线菌活性产物的分离与鉴定

秦岭太白山区放线菌活性产物的分离与鉴定

在天然资源中，找不到活性物质而不是化学农药，并用天然活性物质来保护植物已成为研究的重点。放线菌资源在天然资源中占相当大的比例,其活性产物抗生素是微生物农药的重要来源之一。自1988年起,作者所在课题组对秦岭太白山区的放线菌区系及其资源分布进行了研究,研究过程中分离筛选到了多株能产生高抑菌活性物质的菌株。其中已经报道的瑞拉菌素产生菌产生的瑞拉菌素已通过省级鉴定,在进一步的研究中又分离得到了一株对小麦赤霉病菌、稻瘟病菌、黄瓜枯萎病菌和番茄枯萎病菌等有强拮抗作用的s-930-6菌株,鉴定其为直丝淡紫灰链霉菌秦岭变种(Streptomyceslavendularectusvar.qinlingensis)。作者研究了从其发酵液中分离提纯出的活性产物的抑菌活性,并对纯化的单一活性组分进行了初步鉴定。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株和菌株s-930-6菌株:从采自秦岭太白山区的土样中,用高氏合成1号培养基在28℃恒温分离培养7～9天所得;供试病原菌:稻瘟病菌Magnaporthegrisea、小麦赤霉病菌Fusariumgraminearum、小麦根腐病菌Bipolarissorokiniana、玉米大斑病菌Exserohilumturcicum、黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum.(Schl)f.sp.cucumerinumOwen、番茄枯萎病菌Fusariumoxysporum(Schl)f.sp.lycopersici(Sacc.)SnyderetHansen、番茄早疫病菌Alternariasolani(EllisetMartin)、小麦白粉病菌ErysiphegraminisDeCanDoolef.sp.triticiEm.Marchal、黄瓜霜霉病菌Psudoperonosporacubensis(BerkleyetCurtis)Rostowzew;盆栽试验供试作物:小麦(小偃6号)和黄瓜(丰收6号)。1.1.2黄豆玉米粉养基组成测定抑菌活性测定培养基为PDA培养基;发酵用培养基组成:黄豆粉15g、玉米淀粉17g、葡萄糖4g、硫酸铵3g、磷酸氢二钾0.8g、碳酸钙5g、氯化钠0.4g、水1000mL。1.2方法1.2.1培养菌株4h将放线菌菌株接入发酵培养基中,28℃恒温水浴摇床培养72h。发酵液60℃水浴15min。用0.5mol/L草酸调pH至3.5,静置2h后过滤,收集滤液备用。1.2.2抑菌活性测定发酵液在旋转薄膜蒸发器中80℃下减压浓缩至原体积的1/10,用6mol/L的NaOH调pH至7.0,4000r/min离心30min,弃沉淀,取上清液,加10倍体积的酒精沉淀,弃上清液,收集沉淀,80℃烘干,即得粉状粗提物。将粗提物溶解于蒸馏水中配制一定浓度,分别用生长速率法和孢子萌发法进行抑菌活性测定。每个浓度重复3次,试验重复2次。1.2.3精提物的制备粗提物溶于重蒸水中,过D101大孔吸附树脂柱,40%丙酮洗脱,洗脱液挥发除去丙酮,80℃减压浓缩,加10倍体积酒精沉淀,收集沉淀,80℃烘干即得精提物。先用生长速率法测定精提物抑菌活性,再进行盆栽活体试验。盆栽试验设置3个浓度:500、250、100mg/L,以浓度为200mg/L的2%农抗120和清水为对照,分别做防治小麦白粉病和黄瓜霜霉病试验。每个浓度重复3次,试验重复2次。1.2.4精细提取物的纯度和初步鉴定精提物用高效液相色谱(HPLC)进一步纯化,指示菌跟踪生测,对高抑菌活性的单一组分进行初步鉴定。2结果与分析2.1菌株间的芽孢杆菌对s-400-6的分子激素的抑制作用生长速率法测定表明,s-930-6发酵液粗提物对稻瘟病菌的抑制效果最差,其EC50为261.8g/L;对小麦根腐病菌的菌丝生长抑制作用最强,EC50为2.6g/L;对小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌和玉米大斑病菌等5种病原菌的菌丝生长也有一定程度的抑制作用,EC50分别为13.8、19.3、14.2、11.09、72.2g/L(表1)。孢子萌发法测定结果表明,s-930-6发酵液粗提物能明显抑制黄瓜枯萎病菌和番茄枯萎病菌的孢子萌发,EC50分别为0.04、0.02g/L;对稻瘟病菌和小麦根腐病菌的孢子萌发抑制作用较小,EC50分别为27.46、5.18g/L;对其它3种病原菌没有抑制作用(表2)。2.2试菌的抑制作用由于精提物数量减少,所以只采用粗提物抑制效果较好的病原菌进行生测。研究结果表明,s-930-6精提物在500mg/L浓度下对5种供试菌均有抑制作用,其中对小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制效果都超过了85%,对黄瓜枯萎病菌的抑制效果最好,达96%(表3)。s-930-6发酵液精提物对小麦白粉病有一定的保护作用,在500mg/L浓度下达到了76.39%,但治疗作用不明显,没有超过55%。精提物对黄瓜霜霉病即有保护作用又有治疗作用,在500mg/L浓度下,保护效果为82.38%,治疗效果为78.31%(表4)。2.3抑菌活性的测定用高效液相色谱对s-930-6发酵液精提物进一步分离纯化。色谱条件为:C18柱,0.9cm×30cm,10μm正丁醇:冰乙酸:水=4:1:1(体积比);2mL/min;UV:310nm;进样量100μL,浓度20%。经分离得到A、B、C、D4个单一组分,以小麦赤霉病菌为指示菌进行抑菌活性测定。结果表明:组分A对小麦赤霉病菌的抑制率为33.20%,B为94.14%,C为61.58%,D无活性。对B组分的初步鉴定结果表明:B组分为棕褐色粉末,易溶于水,熔点237～239℃。用正丁醇:冰乙酸:水=4:1:1薄层层析展开,以邻苯二甲酸-苯胺显色剂喷后,于110℃烘烤5min,在Rf=0.40处显现棕色斑点,表明有糖苷存在;以1%茚三酮水溶液喷后再在110℃烘烤5min,在Rf=0.40处有浅红色斑点出现,表明有亚氨基存在。由以上分析可初步确定B组分为氨基糖苷酸类化合物,其分子式有待进一步确定。3抑菌活性测定结果在放线菌产生的活性物质研究过程中,活性追踪生测是必需的,由于活性物质对病原菌的作用方式不同,同一物质用不同的生物测定方法表现出的活性不同。本研究中,s-930-6发酵液粗提物对黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌和小麦根腐病菌的菌丝生长和孢子萌发均有抑制作用,但同一病菌的菌丝和孢子对粗提物的敏感程度不一致。在生长速率法测定结果中,粗提物对小麦根腐病菌表现较强的抑制作用,而在孢子萌发法测定结果中,粗提物对黄瓜枯萎病菌和番茄枯萎病菌表现较强的抑制作用。活体生物测定是比较接近于自然条件的生物测定方法。本研究中,以小麦白粉病菌和黄瓜霜霉病菌为供试菌做了活体生测。结果发现s-930-6发酵液精提物对两种病原菌有一定的防治效果,而精提物对其它供试病原菌在活体上的作用,则需在得到大量的精提物后进一步研究。研究表明,s-930-6号菌株从其发酵液的