基于uplc-ms技术比较赤芍和白芍抗炎作用机制

基于uplc-ms技术比较赤芍和白芍抗炎作用机制

在代谢组中，主要使用生物质量分析、多囊质量分析、生物信息和计算机科学等方法对生物溶液中内源性代谢物的变化进行研究，并正在广泛应用于中医学的研究中。自古以来,芍药在医家的眼里一直是具有多种功效的传统中药,有赤、白之分。赤芍和白芍基源相近,主成分相同,经历代医家不断丰富赤、白芍各自的功用,逐渐重视两者的区别。现代药理学研究结果表明,赤芍和白芍具有抗炎、抗凝血、免疫调节等作用,两者之间既有区别又有联系,具有鲜明的中医药特色。在前期对赤芍与白芍进行药理作用比较研究的基础上,本实验采用UPLC-MS方法分析角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型和赤芍、白芍给药后大鼠血清的代谢物指纹谱,使用多元模式识别方法分析给药组与正常组大鼠血清的代谢物差异,寻找与赤芍和白芍抗炎作用密切相关的潜在生物标记物,为深入探讨其作用机制奠定基础。1材料表面1.1实验动物SD雄性大鼠,180~220g,由上海中医药大学实验动物中心提供,合格证号SCXK(沪)2003-0002。1.2毛科植物兽药paeonieveitchiilus和p.lactiflusa带点赤芍药材购自四川(重庆,批号cs20100101),白芍药材购自上海药业有限公司(安徽,批号bs20100301),经上海中医药大学吴立宏副研究员鉴定分别为毛茛科植物芍药PaeoniaeveitchiiLynch和P.LactifloraPall.的干燥根,标本保存在上海中药标准化研究中心。取赤芍和白芍药材各1.0kg,分别加8倍量80%乙醇溶液回流提取3次,每次2h,合并提取液,减压回收,得浸膏,冷冻干燥,得粉末。1.3仪器、试药和仪器WatersAcquityUPLCSystem,ZQ2000quadtruplespectrometry(Waters公司,USA);YLS-7A足趾容积测量仪(山东省医学科学院设备站);HettichUNIVERSAL32台式冷冻离心机(GermanyHettichCorporation);低温高速离心机(三洋公司,日本)。角叉菜胶(SIGMA,批号90K1535);阿司匹林(SIGMA,批号048K0015)。甲醇、乙腈(色谱纯,Tedia公司,USA);水为MilliQ超纯水(Millipore,Bedford,USA);乙酸铵、冰乙酸(色谱纯,Fisher公司,Nepean,Ont.,Canada)。2方法2.1致炎及血清观察雄性SD大鼠40只,按体重随机分为4组,即模型组、阳性对照组、赤芍和白芍给药组。各给药组大鼠适应性饲养3d后灌胃给予实验供试液,给药剂量折合成生药量为15g·kg-1;阳性对照组灌胃给予阿司匹林50mg·kg-1,给药容积0.01mL·g-1,供试液均用双蒸水配制,模型组灌服同容积生理盐水,连续给药6d。第6d给药1h后,分别在每鼠右后足趾皮下注射1%角叉菜胶混悬液0.1mL,分别于致炎前及致炎后30min,1,2,3h分别测定足趾体积并计算肿胀度。各组大鼠致炎3h后分别于腹主动脉收集血液,至室温下静置2h析出血清,4000r·min-1离心10min,取上层淡黄色透明血清-80℃保存。取100μL解冻后血清加入400μL乙腈-甲醇(3∶1)混合溶液沉淀蛋白,4℃下12000r·min-1离心15min,移取上清液供UPLC-MS分析。2.2柱温b计算色谱条件:WatersHSST3色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm);流动相5mmol·L-1乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸,A)-乙腈(B),梯度洗脱,0~1min,98%A;1~3min,98%~50%A;3~12min,50%~40%A;12~16min,40%~10%A;16~20min,10%~98%A。流速0.3mL·min-1;柱温45℃;进样量5μL。质谱条件:电喷雾离子源(ESI),正离子模式;鞘气(N2)流速30L·min-1;辅助气(N2)流速10L·min-1;毛细管电压38.00V,毛细管温度300℃,毛细管源内电压5.00kV,扫描范围m/z100~1000.00。总离子流图见图1。2.3两组患者差异比较药理实验数据以x珋±s表示,采用统计学软件SPSS12.0的独立样本t检验进行组间差异比较。LC-MS数据通过m/z识别、MassLynx软件匹配、归一化等计算过程得到矩阵,导入SMCA-P12.0(Umetrics,Umea,瑞典)软件中进行主成分分析(PCA)与偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。3结果3.1角叉菜胶致足外水肿的抑制作用实验结果表明大鼠连续给药6d后,赤芍和白芍提取物在0.5~1h对大鼠角叉菜胶致足趾肿胀均有较好的抑制作用,与模型组相比有显著性差异,但组间无明显差别;在2~3h仅赤芍提取物对大鼠角叉菜胶致足趾肿胀有较好的抑制作用,与对照组相比有显著性差异,见表1。3.2hmdb网站初鉴定将LC-MS结果进行PCA和PLS-DA分析。模型组与赤芍和白芍给药组样本点完全分离,且各组内样本点聚集较好,说明大鼠口服给予赤芍和白芍提取物后机体生理及物质代谢状况已经发生明显改变,并根据其变化可以将各组样品进行区分,结果见图2。给予白芍提取物3h后代谢物组轮廓更趋近模型组成分区间,与药理实验结果一致。使用变量重要性投影(VIP)评价潜在的生物标识物,利用PLS-DA计算VIP值,取大鼠血清代谢物谱中VIP值大于1的变量为生物标示物,共发现691个。通过HMDB网站检索,初步鉴定部分可能的生物标识物见表2。炎症是具有血管系统的活体组织对组织损伤或致病因子侵入所发生的防御反应,其典型特征为局部红、肿、热、痛、功能障碍,炎症局部组织可发生变质、渗出、增生。多不饱和脂肪酸花生四烯酸可通过环氧化酶途径和脂氧化酶途径分别代谢为前列腺素(prostaglandins,PGs)、血栓素(thromboxane,TXs)、白三烯(leukotrienes,LTs)等代谢物,在炎症和免疫反应中起重要调节作用。炎症发生时,PGEs能增加微静脉、毛细血管后微静脉的通透性,并通过间接刺激组胺和缓激肽释放,后者增加血管通透性的作用比PGEs要强。但是炎症的发展不是因为PGs总量的变化,而是不同类型PGs间的平衡失调所致。同时PGs还具有趋化白细胞、抑制溶酶体酶的释放、致敏和致痛,以及与其它炎症介质如自由基、白介素-1等的密切相关。由因子载荷图及结合原始图谱数据分析,赤芍、白芍给药组中白细胞三烯A4和前列腺素E2的相对含量下降,但与模型组无显著性差异。赤芍和白芍能显著提高炎症大鼠血清中前列腺素E3的水平和降低前列腺素F2α的水平,与模型组相比均有显著性差异,见图3;而前列腺素E3有抑制前列腺素E2合成的作用,说明赤芍和白芍的抗炎作用可能与影响机体内前列腺素F2α和前列腺素E3的水平有关。在实验中前列腺素F2α和前列腺素E3的不同组别间的相对浓度变化符合一般炎症的规律,赤芍和白芍给药间组前列腺素F2α和前列腺素E3的水平也有显著性差异,提示其抗炎作用靶点可能不同,有待于进一步研究。4赤充物对大鼠血清代谢的影响本研究建立角叉菜胶致大鼠足趾肿胀动物模型,观察赤芍和白芍的抗炎作用,结果表明赤芍和白芍均有较好的抗炎效果,但是作用时间与强度有差别。同时建立了超高效液相色谱-电喷雾质谱分析大鼠血清样品代谢物指纹图谱的方法,并进行了赤芍和白芍对角叉菜胶致足趾肿