植物代谢组学研究进展

植物代谢组学研究进展

随着系统生物学的发展，科学生活研究进入了后基因组时代，更加注重功能基因的研究。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后出现的一门新学科,已成为后基因组学时代的一个非常重要的分支。20世纪90年代末,代谢组学的概念就已经在微生物领域出现,随后Trethewey提出了代谢组学在植物领域的重要性。代谢组是指某一组织或者细胞在一特定生理时期内所有低分子量的代谢产物(基因表达终产物),植物代谢组学则是对植物的某一组织或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析。它是以组群指标分析为基础,以高通量检测和数据处理为手段,以信息建模与系统整合为目标,从宏观角度研究生物机体的生化变化,从而监控或者评价基因功能。与微生物和动物相比,植物代谢物种类繁多,其中大部分次生代谢产物具有重要的生物学功能和商业价值,因而大量应用在药品、食品、抗氧化剂、香味剂和天然色素等方面。目前已知植物代谢产物达20万种之多,仅拟南芥Arabidopsisthaliana就预测有超过5000种初级和次生代谢产物。相比之下,微生物仅有1500种代谢物,动物也只有2500种代谢物。当然海量的植物代谢产物也为科学研究带来了一定的困难。代谢组学为较为全面地研究植物复杂代谢过程及其产物,从而为分析植物次生代谢网络结构、限速步骤,解析细胞活动过程,以及寻找植物间的亲缘关系等等提供了可能,同时也为阐明中草药“黑箱体”,更好的评价中药,为人类所用提供了一个良好的平台。研究如此大量、复杂的化合物,需要依赖于先进的实验设备和数据分析方法的改进。植物代谢组学进行的是无差别代谢成分全分析,代谢物的数量和化学特性都是未知的,所以分析方法必须对较多的物质有一定的灵敏度并且要避免忽视某种或某些特定的化合物。现在普遍应用在植物代谢组学研究方面的分析技术有NMR,GC-MS,LC-MS,FTMS和CE-MS,然而它们在对特定化合物的分析或者灵敏度或者选择性方面均有一定的局限性。高通量分析技术为研究纷繁复杂的植物次生代谢体系提供了可能,同时也产生了前所未有的海量数据。因此,如何利用统计学、生物信息学方法从海量数据中获得有意义的信息已成为研究能否取得成功的非常重要的环节。目前常用的分析方法有多元回归(multipleregression)、判别分析(discriminantanalysis)、主成分分析(principalcomponentanalysis)、聚类分析(hierarchicalclusteranalysis)、因素分析(factoranalysis)和经典分析(canonicalanalysis)等等。分析技术和数据处理技术的快速发展将推动植物代谢组学迅猛发展。近年发展起来的多级联用技术、UPLC等等都为植物代谢组学研究提供了巨大的推动力。将植物代谢分析的结果与转录组学、蛋白质组学和基因组学相结合将有利于建立基因和代谢产物之间的完整网络关系,从而为从基因、蛋白和代谢角度进一步全面阐明植物代谢规律及其关键步骤打开了智慧之门。对于中药研究来说,利用现代分析技术,从不同层面深入阐明初级及其次生代谢产物,为开发中草药打好基础。对于中药而言,可以利用植物代谢组的研究方法和思路对各原料药有效成分进行动态监测,从而克服采用不同原料药材的中药成品质量不稳定的弊端,应用现代代谢组学研究方法对道地药材进行指纹图谱水平鉴别,严格控制中药原药材质量。在现代中药系统研究的指导思想上,建立符合多成分、多靶点、整体调节的中医药基本思想的研究方法,以现代技术进行有效的科学表征。建立基于代谢组学思想的化学分析平台得出的中药组分各种指纹化图谱(数据库),作为通用的准则抢占国际标准的制高点,将成为中药现代研究的一个基本突破口。建立完善的标准组分库是现代中药创制的前提性基础研发资源,魏陆海等认为应着重做好以下几方面工作:建立符合GMP中药生产的控制检测(包括栽培、药材分级和炮制加工)体系;建立生药质量控制标准体系;建立新药研制与代谢图谱库;构建优质、道地、珍稀中药材DNA分子标记与基因库。而代谢组学在解决这些领域的问题时,有其他方法无法比拟的优势。1指纹图谱技术代谢组学应用的高灵敏度、高通量检测技术,可同时对大量代谢物进行定性定量分析,较为全面地研究植物不同时期或者不同部位代谢物种类与含量变化,并进一步通过这些变化来推测相应的代谢途径和代谢网络;也可用来研究不同生长环境对植物代谢的影响,从而对植物进行分类,推测亲缘关系。由于植物利用复杂的机制来维持体内主要代谢物水平的相对稳定,因此对植物代谢组的分析力求可检测样品中每种代谢物,这是进行功能基因组学研究和植物质量控制的基础。Fiehn对笋瓜Cucurbitamaxima的叶柄脉管和叶片抽提物进行GC-MS分析,得到了400多个峰,通过与质谱数据库比对,初步鉴定出90个化合物,并比较了叶柄与叶片之间在糖、氨基酸等代谢物组分方面的差别。Kim对3种麻黄植物Ephedra进行了核磁氢谱指纹图谱分析,通过主成分分析找到了它们之间的代谢物差异,证明指纹图谱分析是植物化学分类学的一个有力工具,并为其全面质量控制带来了可能。中药做为一个复杂成分体系,应用代谢组学技术对其进行全面质量控制,保证中草药的药效稳定可靠性,可以归属为中药指纹图谱技术。一方面,针对中药及其制剂产品进行大量的指纹图谱研究,建立系统的测定方法和全面的指标控制参数,通过和使得数学模型的建立,表征中药的特性,表达成品的质量,以达到对原药材和工艺操作的质量控制,达到指纹图谱的可操作性、稳定、量化的目的,提高中药质量控制的水平。另一方面,将传统的植物化学纯化分离技术与现代的基于色谱-质谱联用技术对指纹图谱中的指纹峰进行系统的指认和定量研究,寻找指纹特征和药效的相关性,即“谱效关系”研究,探讨指纹图谱的生物等效性研究等,使指纹图谱技术更加合理可靠的控制中药质量。因此,基于代谢组学思想的化学分析平台得出的中药成分指纹图谱(数据库),包括了体现药效信息的多个有效部位的各种指纹图谱,作为通用的准则抢占国际标准的制高点,将更进一步解决如何体现中药和制剂的整体性和复杂性的难题,是中药现代化研究的一个重要的突破口。2对优良品种筛选的作用对突变型或者基因改造型植物的代谢变化和正常野生型的差异进行比较,或者对组织培养得到的代谢产物与野生型之间的差异进行比较,评价基因改造或者组织培养的效果、筛选优良品种等有重要作用。随着生物技术的进步,这方面的研究将越来越广泛。Murch采用HPLC-MS对黄芩Scutellariabaicalensis代谢成分进行研究,发现了2000个成分,并对其中的781个成分进行鉴定,从而为筛选、评价优良品种建立了筛选模型。Davuluri应用代谢组学方法研究了基因改造西红柿中与人体健康相关的成分类胡萝卜素和解毒的黄酮类成分与野生株的差别,同时也用代谢轮廓的方法研究了来自葡萄的1,2-二苯乙烯基因的转基因西红柿中的新的解毒成分。Fukusaki应用代谢组学研究方法,采用GC-MS从拟南芥中鉴定了48个成分,用多维统计方法研究了拟南芥叶和培养细胞T87的差别,确定了培养细胞T87的代谢物差异,证明了细胞培养的优势。对于珍稀名贵中药材,代谢组学提供了全面评价培养型和野生型之间的异同,筛选优良品种等方法学平台,为是解决资源匮乏中药材提供了可能。3其他植物细胞代谢所谓监测植物代谢产物,就是指通过外源化学药品刺激、物理刺激或者生物刺激从而引起植物代谢产物的改变,通过代谢组学方法对这种变化进行监测与全面分析,找出差异,从而找到植物代谢的规律及其关键步骤。Hirai应用HPLC-FTMS技术研究发现硫磺和氮对拟南芥中芥子苷的代谢途径具有重要影响,并显示出相当大的相关性。Broeckling在苜蓿细胞培养过程中加入生物和非生物的细胞诱导剂,观察其对苜蓿代谢的影响,然后应用GC-MS和LC-MS对苜蓿的代谢产物进行检测,结果表明许多初级代谢产物发生了显著性变化,而这些初级代谢产物的改变量随着其他初级代谢物对某种诱导剂的敏感而减小,从而证明代谢网络中不同代谢产物之间具有相关性。以上研究均表明随着外界条件的改变,植物体内的代谢调节是一个相互作用的代谢网络。同时也说明植物代谢组学对研究植物体内复杂生理代谢物的波动是一种非常有效的方法。4丛枝菌根真菌共生的烟草根物质谱图目前主要应用于共生过程和水果成熟过程的研究,通过对整个发展过程的代谢组学分析,找到该过程中的变化规律。Maier等研究了丛枝菌根真菌对烟草根部代谢的影响,对比了有丛枝菌根真菌共生的烟草根和没有共生该真菌的烟草根的代谢物差异。HPLC-UV检测结果表明有真菌共生的烟草根比无真菌共生的烟草根代谢物多了许多布卢姆醇衍生物,该文章也是首次对有丛枝菌根真菌共生的烟草根进行研究。Aharoni等研究了番茄成熟过程中茄红素等一系列代谢产物的动态变化过程,从而对番茄的成熟机制有了进一步的了解,为加快番茄成熟速度打好了基础。生理变化研究对于药用植物而言,研究不同采收期植物有效成分的变化等生理变化过程,应用现代科技验证传统中药理论,是中药现代化非常重要的一部分。5马铃薯斑块的代谢组学研究为了阐明代谢途径,首先应用代谢组学的无偏分析技术系统研究并找出与某一代谢途径相关的全部代谢物;然后进一步证明该代谢途径,应找到与该途径相关的一系列底物、中间产物和末端产物以及关键酶,并阐明该代谢途径的调节机制和关键调节位点。Rolleston早在1972年就提出调节位点的底物和关键酶浓度将发生相反变化,用代谢组学手段则可以方便地找到调节位点。Tiessen等用HPLC对马铃薯块茎进行代谢组分析,同时检测了马铃薯块茎淀粉合成途径中的一系列底物、中间物、酶及其产物含量的变化,然后通过对野生株和含有异源腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)转基因株马铃薯进行对比研究,提出了淀粉合成途径中一种新的调节机制,即在离开母体情况下,马铃薯块茎中淀粉合成关键酶AGPase的催化亚基AGPB会发生可逆的氧化还原反应形成二聚体,使AGPase失活,从而抑制淀粉合成。研究纷繁复杂的中草药次生代谢产物,提高活性成分的含量,就必须深入了解代谢途径及其调控机制,才能正在从分子水平控制次生代谢物的合成方向,深入开发中药。6马铃薯叶代谢特征代谢产物是基因表达的终产物,基因表达水平的极微小变化也可导致代谢物的大幅改变。以往通过可见的表型改变来判断基因表达水平的升降,耗时较长,而且有时候基因表达变化无法引起表型改变,而此时植物体中某些代谢产物的含量却已经发生显著变化。利用代谢组学方法检测代谢物的变化则可以判断基因表达水平的变化,从而推断基因的功能及其对代谢流的影响。Urbanczyk-Wochniak等应用GC-MS对马铃薯叶片的糖代谢物和其他初级代谢产物进行了检测,并且应用基因芯片研究了马铃薯初级代谢相关转录基因。发现马铃薯叶子中的基因表达的变化与马铃薯代谢的显著变化之间有较大的相关性,其中有56种代谢物质发生了显著性变化。昼夜变化过程中,虽然基因表达水平较低,但是马铃薯叶子中的糖代谢等都发生了显著变化。这说明代谢产物可以放大基因表达的变化,从而在基因型和表现型之间的相关性研究中建立了一座桥梁。7转录组学研究及其应用基因组学:基因代谢组学[将代谢轮廓分析与数量性状基因座quantitativetraitlocus(QTL)分析结合]是鉴定控制代谢产物基因座的新工具。目前这方面的研究仅限于模式植物。Morreel应用基因代谢组学对模式植物——杨属植物黄酮类成分的生物合成途径进行研究,确定了美洲黑杨14种黄酮类成分的生物合成途径,并且用QTL分析确定了生物合成途径中的关键调控步骤的基因。Keurentjes应用LC-TOFMS技术首次对拟南芥进行了无偏向的基因代谢组学研究。该研究检测到2000个质谱峰,并对其中75%质谱峰进行了QTL识别。应用该方法,他们不但发现了拟南芥中新的代谢途径,而且还研究了不同地域及其亲缘关系的拟南芥的代谢网络与其基因网络之间的关系,开创了植物基因代谢组学的先河。Nicolas对野生和突变的西红柿进行了全面代谢轮廓分析和功能基因的分析,检测到与西红柿营养相关的代谢物基因50%和QTL识别相关。根据得到的基因代谢轮廓对西红柿不同株进行分类,并且揭示了与显性相关的代谢产物和与显性不相关的代谢物。转录组学:在这方面,模式植物的研究报道比较多。Hirai等利用FT-MS对拟南芥叶和根进行无目标代谢组分析,检测到了大约2000个代谢物,同时又用HPLC-MS对拟南芥的糖类、氨基酸类进行目标代谢组分析。然后基于微阵列方法mRNA分析技术检测到了21500个转录物,应用BL-SOM数据分析技术,将转录组和代谢租的数据进行整合,推测出与拟南芥糖代谢相关的调控基因。Ferrario-Mery等研究了烟草中关于碳氮的代谢途径,整合了该代谢路径中转录组、酶活性及代谢组学的相互关系。通过对NH4+代谢过程中主要代谢物的定量分析,并整合先前关于氮在转录方面的知识,分析了谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase)在氮代谢过程中的作用,得到结论是代谢物量的变化与转录水平无关,而与转录后修饰调节有关。对于非模式植物来说,由于基因组全序列信息及其相关数据库的缺乏,因此基于微阵列方法(模式植物常用)的转录组分析是相当困难的。因为这种方法需要前期的大量EST数据库或cDNA文库知识,或者需要大量的资金和人力投入。cDNA-AFLP是由AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)衍生而来的一种RNA指纹识别技术,该方法不需要先前的基因序列知识即可对基因进行鉴别,提高基因表达水平的定量信息,更为重要的是还可以对新基因进行鉴定。Rischer建立了长春花中吲哚生物碱类生物合成途径的代谢基因网络系统,用cDNA-AFLP转录轮廓分析技术(Transcriptprofiling)确定了178个代谢峰与417个基因标签之间的关系。该系统揭示了不同诱导剂对长春花吲哚生物碱代谢的影响,同时也揭示了一系列与长春花吲哚生物碱类的生物合成相关的代谢物和基因。蛋白质组学:DNA→mRNA→蛋白质→代谢产物是生物信息的流动方向,与之相对应的蛋白质组学和代谢组学是一个有机的整体,将所获得的相关信息联系起来,将有利于从整体水平研究生物系统对基因或环境变化的响应,从而更加准确地判断代谢物的变化是从哪一个层面发生的。Jean-EmmanuelSarry等通过镉对拟南芥细胞的影响,测定不同时间点拟南芥代谢物轮廓和蛋白质组的变化,并将代谢轮廓和蛋白质组整合,从而阐明镉对拟南芥代谢物的影响与6个不同家族的植物络合肽蛋白相关。8人体-疾病-中药的互联互通随着新的分析检测技术和生物信息学的发展,代谢组学作为一个研究平台,为植物代谢研究提供了全面、多维的视角,从而为