双缩脲法测蛋白质浓度

一、 目的：1•了解双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理。2•熟悉双缩脲法测蛋白质浓度的实验操作方法。二、 原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180°C左右加热，放出1个分子氨后得到的产物在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。三、 实验试剂和仪器硫酸铜、酒石酸钾钠、NaOH、KI、酪蛋白双缩脲试剂：取0.75g硫酸铜和3.0g酒石酸钾钠溶于250ml蒸馏水，加入150ml10%NaOH溶液（可另加0.5gKI以防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水稀释至500ml。此试剂可以长期保存。10mg/ml标准蛋白溶液：取1.0gNaOH加入500ml蒸馏水中，配成0.05mol/lNaOH溶液。用0.05mol/lNaOH溶液溶解0.25g酪蛋白，定容至25ml。待测样品液：可以用酪蛋白配制，也可用蛋清，牛血清蛋白。仪器：容量瓶，试管，移液管，量筒，烧杯，胶头滴管，吸耳球，洗瓶，分光光度计四、 步骤标准曲线的绘制（表1）。加入物加入量（ml）012345标准液0.00.20.40.60.81.00.05mol/lNaOH1.00.80.60.40.20.0双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.0室温下振荡均匀，显色30min后，用分光光度计于540nm测定各管吸光度。以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。样液配制（表2）。加人物0.05mol/l的NaOH空白牛血清蛋白原液稀释5倍牛血清蛋白稀释10倍牛血清蛋白稀释20倍牛血清蛋白稀释30倍牛血清蛋白20mg/ml酪蛋白溶液稀释4倍20mg/ml酪蛋白样液0.01.01.01.01.01.01.01.0

(ml)0.05mol/l的NaOH1.00.00.00.00.00.00.00.0双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.04.04.0室温下振荡均匀，显色30min后，用分光光度计于540nm测定各管吸光度。根据标准曲线计算个样品浓度。五、结果标准曲线1012345蛋白质浓度（mg/ml）02.04.06.08.010.0光密度0.0000.0880.1690.2600.3500.426分析结果牛血清蛋白原液稀释5倍牛血清蛋白稀释10倍牛血清蛋白稀释20倍牛血清蛋白稀释30倍牛血清蛋白20mg/ml酪蛋白溶液稀释4倍20mg/ml酪蛋白光密度0.7730.5410.2350.1270.0850.6370.200样液蛋白质浓度（mg/ml）17.9612.575.452.941.9614.804.63蛋白质原浓度（mg/ml）17.9662.8254.4858.7458.8114.8018.54六、讨论为提高准确度将之前标准曲线绘制的蒸馏水换成0.05mol/lNaOH溶液。样液+蒸馏水+双缩脲试剂的总体积为5ml,体积不一样，蛋白质浓度计算不方便。标准曲线选择不能只看R2,还应该看曲线斜率和截距。R2大小与实验操作和仪器都有关系。配蛋白质溶液应用的是0.05mol/L的NaOH配制，用0.05%NaOH可能会影响干酪素的溶解效果。（但实验结果分析显示，低浓度的NaOH对实验结果影