二次回归正交旋转组合设计法优化藤茶黄酮提取工艺

二次回归正交旋转组合设计法优化藤茶黄酮提取工艺

藤茶提取物w.t.杰作主要产于中国，主要分布在湖北省、湖南省、广东省、江西省、福建省、云南省和贵州省等海拔200.13万米的山区。藤茶的主要活性成分是以二氢杨梅素为主的黄酮类物质,具有降血脂、消炎和清热解毒功能,是我国特有的一种茶用和药用植物。除了将藤茶作为茶用以外,目前已提取藤茶黄酮生产药品和饮料等。藤茶黄酮的提取工艺主要有水提和醇提2种方法,并以水提法研究较多。王岩等用正交法探讨了乙醇浓度、用量、提取时间和次数对藤茶二氢杨梅素的影响。杨铃用正交设计法,考察了微波提取的温度、辐射时间及料液比3个因素对藤茶中二氢杨梅素得率的影响。成凤桂探讨了以水为提取剂,提取温度、时间和体积对藤茶黄酮提取率的影响。以水为提取剂,虽然提取剂成本低,但提取温度高、时间长,黄酮提取率和纯度低,增加了后续分离纯化的难度,同时在长时间高温作用下,势必降低黄酮活性。笔者在前期试验的基础上,采用乙醇为提取剂,以清除超氧阴离子自由基活性为跟踪,应用二次回归正交旋转组合设计方法优化藤茶黄酮及二氢杨梅素提取的最佳条件,旨在为工业化生产提供理论依据。1材料和方法1.1样品、醇、杨树酸酯fps供试藤茶来自湖北省恩施风鸣藤茶有限公司。样品粉碎后过孔径0.35mm筛待用。甲醇:色谱醇,购自Fisher公司;二氢杨梅素:笔者所在实验室自制,纯度达98%;其它试剂都为国产分析纯。1.2测试方法1试验工程黄酮提取条件采用二次回归正交旋转组合设计,试验因子、水平及编码见表1。2黄酮提取工艺流程:藤茶→石油醚回流脱脂1h→提取→提取液45℃条件下真空浓缩至小体积后冷冻干燥得粗黄酮。3黄酮含量是测定的采用AlCl3比色法测定样品中的黄酮含量。4色谱柱及色谱柱采用HPLC法测定样品中的二氢杨梅素(DHM)含量。测定条件:DiscoveryC18色谱柱,250mm×4.6mm,5μm。流动相:甲醇/0.1%磷酸(25/75),流速0.8mL/min,进样量30μL,温度30℃,检测波长292nm。53超氧离基硅酮的去除采用SOD试剂盒(南京建成生物研究所生产)进行清除。试验数据采用SAS统计软件包分析处理。2结果与分析2.1藤茶中二氢杨树叶片黄酮提取率的响应面分析供试藤茶各处理黄酮和二氢杨梅素提取率及活性结果见表1。试验结果表明,浸提温度、时间、料(g)液(mL)比对藤茶黄酮的浸提率都有显著影响。通过SAS软件包分析,得到二次回归方程:经检验,模型的一次项和二次项都达极显著水平,交互作用项不显著(表2)。分析结果表明,各试验因子对黄酮提取率的影响都达显著水平(表3)。回归模型的预测值与实测值能较好地拟合。藤茶中二氢杨梅素提取率的回归方程:经检验,模型及二次项达极显著水平。一次项及交互项影响不显著。2.2乙醇浸提液浓度对黄酮提取率的影响根据回归方程进行降维分析,结果如图1所示。由图1可以看出,浸提温度、时间和料液比对黄酮浸提率的影响较一致,随浸提温度的升高,浸提时间的延长和料液比的增加,黄酮的浸提率呈先增后减的趋势。说明在一定范围内,升高浸提温度、延长浸提时间和增大料液比有利于黄酮的浸出。在浸提温度1.1463(79.3℃)、浸提时间0.3314(100min)、料液比0.8463(1∶31)时,提取率分别达到最大值。而乙醇浓度对黄酮的提取率的影响表现为,乙醇浓度提高时,黄酮的浸出量反而下降,当乙醇浓度为-0.7994(67%)时,黄酮浸出率最高。对粗黄酮的纯度分析表明,粗黄酮的纯度与浸提液乙醇浓度呈极显著相关,相关系数0.9758。说明用高浓度乙醇浸提,其他杂质浸出量减少,有利于黄酮纯度的提高;低浓度的乙醇浸提,黄酮的提取率较高,但其他杂质浸出也增加,不利于黄酮的纯化。对粗黄酮清除超氧阴离子自由基活性分析表明,粗黄酮的提取液浓度与其清除超氧阴离子自由基活性呈显著负相关,相关系数-0.8587。这可能是在低浓度的乙醇浸提时,其他活性成分浸出较多的缘故。粗黄酮的纯度与浸提温度的相关系数为-0.8517,与浸提时间的相关系数为-0.7184,表明随着浸提温度的提高、时间的延长,其他杂质也相应浸提出来,粗黄酮的纯度降低。浸提温度、时间与粗黄酮清除超氧阴离子自由基的活性相关不明显。综合分析后可得藤茶粗黄酮的最佳浸提条件:乙醇浓度-0.8～1水平,浸提温度控制在1～-1水平,浸提时间-1～0.3水平,料液比0.85水平。2.3不同浓度的二氢杨树叶片中二氢杨梅素的提取率对藤茶中二氢杨梅素的降维分析表明(图2),随浸提温度的升高、浸提时间的延长、料液比的增加、乙醇浓度的增大,二氢杨梅素的提取率增加,当各因素增加到零水平附近时达到最大值,即提取温度在-0.0266(64.67℃),时间在0.1206(93.62min),料液比在0.4878(1∶34.88),乙醇浓度在-0.1328(73.67%)水平,藤茶中二氢杨梅素的提取率最高。3藤茶中二氢杨素的提取藤茶中富含黄酮类物质,其中又以二氢杨梅素含量最多。有关黄酮类化合物的提取方法,主要有水提法和含水乙醇提取法。水提法溶剂成本低,但提出的黄酮往往杂质多,纯化困难,增加后续工序难度。采用含水乙醇浸提,初提物黄酮含量高,故选择乙醇的浓度尤为重要。试验结果表明,如果以黄酮为目标产品,乙醇浓度不宜过高,否则黄酮的得率低,清除超氧阴离子自由基活性不高。高浓度的乙醇浸提,黄酮含量降低,可能是因为降低了其它一些水溶性较好的黄酮类成分的溶出造成的,有关原因还有待继续探讨。如果以二氢杨梅素为目标产品,应适当提高浸提液乙醇浓度,以提高产品得率及纯度。因二氢杨梅素是一种双氢黄酮醇类化合物,易溶于丙酮、乙醇,水溶性较差。黄酮是一类热敏性物质,高温容易引起黄酮的氧化分解,因此在浸提时温度不宜过高。本试验结果表明,藤茶黄酮的提取温度应控制在80℃以下,若超过这个温度,黄酮的提取率反而下降。这可能与其在高温下的氧化降解有关。由试验结果可知,在一定浸提温度、浸提时间、料液比范围内,随温度的升高、浸提时间的延长、料液比的增加,藤茶黄酮的浸提率提高,当浸提温度超过1.1463水平、浸提时间超过0.3314水平、料液比超过0.8463水平后,黄酮浸提率下降;与黄酮的得率相反,粗黄酮的纯度随浸提温度的提高,浸提时间的延长而下降。料液比与粗黄酮的纯度无显著相关。提高浸提乙醇浓度,黄酮