柴胡疏肝散对围绝经期综合征肝郁证大鼠海马区雌激素受体er,er,gpr

柴胡疏肝散对围绝经期综合征肝郁证大鼠海马区雌激素受体er,er,gpr

更年期综合征是指更年期前后的卵巢功能萎缩，雌激素水平波动或降低，女性以独立神经系统功能障碍为主，伴有神经心理症状的症状群。中医学称之为“绝经前后诸证”。近年来,许多研究发现围绝经期综合征肝郁证女性的雌激素水平、雌激素受体以及肽类和单胺类神经递质的活性和含量都有明显改变,动物实验亦发现郁证动物海马和下丘脑肽类和单胺类神经递质的变化与其相类似。传统经方柴胡疏肝散能改善围绝经期综合征肝郁证的症状,本研究旨在以“以方测证”的方法研究围绝经期综合征肝郁证发生的生物学机制,探讨雌激素受体表达变化与大鼠海马区神经递质释放的关系。材料和方法1.实验大鼠的分组及饲养条件选取雌性SD大鼠,SPF级[北京维通利华实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(京)2006-2009],13月龄,48只,体质量370-380g;3月龄12只,体质量250-280g。13月龄组大鼠持续30d作阴道涂片,用95%酒精固定,5%碱性美蓝溶液染色5min,吹干,镜检,呈现无持续动情5d以上大鼠作为围绝经期模型鼠,将其随机分为对照组(B组)、对照加中药组(C组),围绝经期综合征肝郁证加中药组(D组)、围绝经期综合征肝郁证组(E组),每组12只。另选3月龄、有规则的动情周期、平均体质量达250-280g的雌性SD大鼠,共12只,作为育龄期空白对照组(A组),与其余各组相同条件饲养。饲养条件:分笼,每笼2只,于昼夜颠倒环境(每日21∶00开灯,9∶00关灯),除实验期外自由饮食、饮水。所有实验操作均在夜间、暗淡红灯下进行。实验过程中对动物处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的实验动物管理条例的规定。2.模型准备和评估2.1动情周期观察、药物干预和等体积、钠围绝经期综合征大鼠造模方法用自然衰老方法;肝郁证大鼠造模方法采用慢性束缚应激方法,采用旷场实验检测大鼠情绪、行为变化以判定造模是否成功,造模时间为3周。经适应性饲养1周后,每日6h,束缚时间点随机。同时进行动情周期观察,选取连续5d不出现动情期的动物进行实验,中药干预组大鼠给予研究团队前期研制的柴胡疏肝散(《景岳全书》原方原剂量组方:柴胡6g,白芍4.5g,枳壳4.5g,川芎4.5g,醋炒陈皮6g,香附4.5g,炙甘草1.5g)水溶液每日灌胃1次(每毫升药液含原生药1g,剂量1mL/100g体质量)。剂量均按临床成人剂量的8倍计算,其余大鼠给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。药物干预3周后处死。2.2静置-离心制备第22天时,所有大鼠空腹戊巴比妥(1mL/100g)麻醉,腹主动脉采血,将获取的新鲜血液于4℃冰箱静置6h后,以3000r/min室温离心10min,取血清,标记后置-70℃低温冰箱中备存;所有大鼠在冰上剥离大脑,迅速分离海马,置冷冻管标记后,立即投入液氮中备用,以防止海马组织内部RNA降解。3.试剂和设备3.1分离、n-n酶联免疫试验剂及检测仪器海马组织匀浆后3000r/min,4℃离心15min,取上清液,参照大鼠5-HT、β-END、NE酶联免疫分析试剂盒(购自武汉华美公司)说明书进行,检测仪器:EIX808U型全自动酶标仪(美国BioTekGC-2010型)。GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems),引物设计软件:Primer5.0]。3.2实际pcr反应用TRIZOL法抽提海马组织总RNA,海马组织总RNA的质量判断使用紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳法测定RNA浓度和纯度。合成cDNA,将所有cDNA样品分别配置Real-timePCR反应体系。体系:(1)2×MasterMix5μL、10μmol/L的PCR特异引物0.5μL加水至总体积为8μL,轻弹管底将溶液混合,5000rmin短暂离心。(2)加样。a.将8μL混合液加到384-PCR板对应的每个孔中;b.再加入对应的2μLcDNA;c.小心粘上SealingFilm封口膜,并短暂离心混合;d.在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。(3)将上述384-PCR板置于Real-timePCR仪上进行PCR反应。反应条件:95℃,10min;40个PCR循环[95℃,10s;60℃,60s(收集荧光)]。为了建立PCR产物的熔解曲线,扩增反应结束后,按(95℃,10s;60℃,60s;95℃,15s);并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行,RampRate为2%)。各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimequantitativePCR反应,见表1。mRNA相对表达量以2-△△Ct表示,△Ct=(CtER-CtGAPDH);以A组作为基线,采用以下公式计算各组ERmRNA表达差异倍数(foldschange)=2-△△Ct,其中△△Ct=(CtER-CGAPDH)实验组-(CtER-CtGAPDH)对照组。4.数据处理组间差异所有数据以表示,利用SPSS17.0软件对数据进行处理组间差异采用方差分析,两两比较用最小显著差异t检验(LSD-t检验),以P<0.01为差异有统计学意义。结果1.马马区雌激素受体的形成2.比较塞尔堡区的mrna和mrna的比较3.5-ht、i-末年和ne含量的比较围绝经期综合征肝郁证相关因素既往研究表明,无论是围绝经期综合征患者还是围绝经期综合征动物模型,不仅体内的雌激素水平降低,而且雌激素受体的数量也有减少。动物实验研究表明,在卵巢切除的小鼠中发现循环雌激素水平的降低是一个不可逆的过程,而雌激素受体的表达却呈现一个可逆的过程,即随着循环雌激素的下降,雌激素受体的表达首先也会下降,但是经过一段时间之后最终又会上升到正常水平。RomanoTorres等的研究结果表明,雌激素对于中年卵巢切除(人类绝经期的动物模型)慢性抑郁模型大鼠具有抗抑郁的作用,雌激素水平下降和孕酮调节功能的丧失可能会导致围绝经期妇女产生心境障碍。此外围绝经期女性的低雌激素血症及体内性腺甾体激素衰退,使中枢和周围的单胺类和鸦片肽类神经递质浓度发生变化是导致植物性自主神经系统和精神症状发生的基础,是发生围绝经期综合征症状的基础。雌激素受体(estrogenreceptor,ER)是雌激素发挥作用的重要节点。AliciaA.Walf等的研究结果提示,雌二醇(estradiol,E2)可能通过卵巢切除大鼠的海马区ERβmRNA发挥抗焦虑和抗抑郁的作用。本课题组前期的研究发现ERβ多态性(rs3020444)与围绝经期综合征肝气郁结证(气郁证)相关,ERβ-TT基因型可能是围绝经期综合征气郁证发病的易感因素之一。由于雌激素的生物效应是由雌激素受体介导完成的,因此有可能雌激素受体的变化影响了神经递质的释放。本研究证实大鼠海马区有雌激素受体的分布,13月龄各组ERαmRNA较育龄空白对照组表达减少,而郁证组与对照组表达有所减少,郁证组ERβmRNA与对照组、中药干预组相比表达增多,但没有显著性差异;各组GPR30mRNA表达没有显著性差异。虽然ERα、ERβmRNA单个表达组间差异不显著,但是本实验首次发现了围绝经期综合征郁证大鼠ERαmRNA/ERβmRNA比值较空白对照组、对照组、围绝经期综合征肝郁证加中药组均有显著性下降,予以中药干预后ERαmRNA/ERβmRNA上升,提示围绝经期综合征肝郁证的产生有可能并不是单个ERα、ERβmRNA的表达变化,而是与其比值有关,因此ERα/ERβ的比例下降可能是围绝经期综合征肝郁证的生物学基础,这一发现对于明确围绝经期肝郁证治疗药物靶点研究有重要意义,即雌激素受体比例ERαmRNA/ERβmRNA变化可以作为肝郁证治疗的研究指标。本课题组没有发现膜受体GPR30mRNA变化,是否是因为膜受体参与快速应答为主,而郁证变化是一个慢性改变过程,其有待进一步研究。围绝经期的雌激素改变导致血清中神经递质含量明显改变。β-END参与垂体促性腺激素的释放、体温调节以及情绪反应,它的改变与围绝经期症状及其程度密切相关。研究显示女性5-HT合成速率较正常男性低52%,间接提示雌激素可以减少5-HT合成。郁证患者普遍存在5-HT、NE、多巴胺(DA)等低下,且在临床上抗抑郁治疗有效的药物几乎都能够增加细胞突触间隙5-HT和NE的水平。雌激素受体广泛分布于中枢神经系统的基底前脑、间脑、中脑、海马、杏仁体、大脑皮质、小脑皮质等位置。但是雌激素通过哪些核团起到抗抑郁作用目前还不明确,海马是目前研究较深入且与抑郁症发病关系最密切的核团,抑郁症患者与正常人相比海马体积减小。许多研究表明在受到应激刺激后海马介导的行为在不同性别动物中的反应不同,这些都说明海马可能是雌激素对抗抑郁症状的一个靶点。本研究证实海马区的5-HT和NE含量在围绝经期肝郁证组显著下降,经治疗后5-HT、NE表达均升高,此结果与既往研究类似,但是β-END的含量各组却没有发现明显改变。围绝经期综合征中医称之为“绝经前后诸证”,历代古籍将其归于“百合病”、“郁证”、“脏躁”、“崩漏”、“心悸”等范畴。绝经本是女子正常的生理现象,正如《黄帝内经》所云:“七七任脉虚,太冲脉衰少,天癸竭,地道不通,故形坏而无子也”。部分妇女不能适应这个阶段的生理过渡,发生气机郁滞,肝失调达的围绝经期综合征肝郁证候,本课题组的前期研究亦认为肝郁是这一时期的主要矛盾,因此本研究用自然衰老和慢性束缚大鼠模型较好地模拟了这特定时期的郁证表现,且经柴胡疏肝散“以方测证”的方法证实了这一理论。以方测证法广泛应用于传统方证认识和现代证候研究,其逻辑基础源于《伤寒论》的“方证相应”。本研究中笔者以“以方测证”方法证明围绝经期综合征肝郁证系列的神经心理变化的生物学基础有可能在于雌激素波动影响海马区ERαmRNA/ERβmRNA表达,引起神经递质5-HT、NE变化,却没有出现肽类递质β-END的改变,此实验结果与既往研究不同。既往研究围绝经期综合征多数选用去势大鼠造模,而本研究选用的是自然衰老的大鼠,较前者更能模拟女性自然的生理变化过程,这也许是结果异于以往研究的原因之一。见图1-图3。用Real-timePCR检测围绝经期综合征肝郁证大鼠海马雌激素受体的mRNA表达。ERαmRNA表达B、D、E组较A组减少,有显著性差异(P<0.01),E组与D组比较,表达有所减少,但没有显著性差异;ERβmRNA表达E组与B、C、D组相比增多,但没有显著性差异;各