高效液相色谱法同时检测3种红黄蓝色素

高效液相色谱法同时检测3种红黄蓝色素

有很多类型的染料。对于儿童食品而言,由于儿童的脏器处于发育期,其消化代谢能力也远不如成人,因此对食品安全的要求更高,常常需要对相关的色素的添加进行严格把关,完善其检测的标准和质量体系。目前我国GB2760—2011《食品添加剂使用标准》及其增补品种规定允许使用的着色剂为64种(类)［1］。其中,胭脂虫红是一种蒽醌类天然色素,目前在我国允许添加于多种类型的食品中,但有报道指出可能引起哮喘患者的过敏现象［2］。喹啉黄为偶氮类合成色素,常用于糕点、冰激凌、软饮料等食品的着色,我国仅允许在预调酒中添加,有导致儿童多动症的风险［3］。此外,食用蓝色素是较为稀奇的一类色素,目前在我国食用的蓝色素有:靛蓝、亮蓝、栀子蓝和藻蓝。碱性蓝类物质是一类不安全的染料,决不可作为食用色素添加于食品［4］。目前,虽然已有文献报道可采用高效液相色谱测定胭脂虫红酸［5，6］、喹啉黄［7，8］和碱性蓝26［9］。但是关于开展儿童食品中分析检测上述着色剂的方法较少,尤其是对这些吸收波长差别较大着色剂的同时检测方法的报道甚少。为此,我们采用高效液相色谱紫外法对目前无检测标准的上述禁限着色剂进行检测方法研究,建立棒冰食品中喹啉黄、胭脂虫红、碱性蓝26的同时检测分析方法,且详细地研究了适合的前处理技术。这不仅为目前允许但限量使用的色素提供行之有效的检测方案,也为禁用色素的检测储备分析方法,对食品安全检测与管理是十分重要的。1实验部分1.1实验设备和试剂LC20高效液相色谱仪(日本岛津公司);Mil-lipore超纯水机(美国密理博公司);万分之一电子天平(瑞士梅特勒公司);pH计(日本Horiba公司);电热恒温水浴槽(上海精宏实验设备有限公司);1-14K离心机(德国Sigma公司)。乙腈、甲醇、醋酸、氨水(分析纯)、色素标准品:碱性蓝26(维多利亚蓝BCAS:2580-56-5)(国药集团化学试剂有限公司);胭脂虫红酸(CAS:1260-17-9)、喹啉黄(CAS:8004-92-0)(TCI试剂公司)。准确称取胭脂虫红酸、喹啉黄、碱性蓝26各10mg,分别倒入100mL玻璃容量瓶中。向其中加入10mL甲醇进行溶解,随后加入水定容至100mL,配置成100μg/mL的标准品溶液,并放置于4℃冰箱中保存。1.2流动相及洗脱条件色谱柱为日本YMC公司原装HPLCColumnHydrosphere-C18色谱柱(250mm×4.6mmi.d.5μm)。流动相A:0.1%甲酸水溶液(氨水调节pH4.0);B:乙腈;流速1.0mL/min,梯度洗脱条件见表1;进样量为20μL。胭脂虫红酸的检测波长为280nm,喹啉黄的检测波长为410nm,碱性蓝26的检测波长为595nm。1.3方法1.3.1标准溶液的配制将色素储备液用超纯水稀释,并配制成含有胭脂虫红酸、喹啉黄和碱性蓝26的标准溶液,浓度分别为100、50、10、5、1、0.5、0.1μg/mL的标准溶液。用0.22μm滤膜过滤后进行液相色谱分析。每个浓度进样3次,取3次平均值,所得色谱峰的浓度和对应的峰面积绘制标准工作曲线。1.3.2标准溶液的配制将购买棒冰去包装纸,置烧杯内溶解后移入干净离心管中保存。将两份2g棒冰待测液精确称量至15mL离心管中,各加入8mL超纯水中,充分混合。其中一份标记为样品,另一份准备加入标准溶液1mL,标记为加标样品。随后,以转速为12000r/min离心15min,弃沉淀和油脂部分,取上清备用。1.3.3样品的前处理脱水洗脱上述样品上清液用聚酰胺SPE小柱净化,净化过程为:先用3mL甲醇和3mL双蒸水冲洗柱子,再用3mL2%甲酸冲洗柱子之后可以上样,2g样品前处理溶液全部上样。随后再用双蒸水洗涤3次,最后用3mL10%氨水-甲醇分别洗脱胭脂虫红酸和喹啉黄,3mL乙腈洗脱碱性蓝26,合并所有的洗脱液。洗脱液在40℃水浴锅中氮吹吹干后用3mL甲醇水溶液(V(甲醇)∶V(水)=1∶9)溶解。该样品溶液置于-20℃冰箱中保存,且可以直接用于色谱分析。2结果与讨论2.1紫外分光光度法检测3种常用试剂的同时检测取10μg/mL胭脂虫红酸、喹啉黄和碱性蓝26标准溶液,在190~600nm波长范围内进行紫外可见光谱扫描,结果表明胭脂虫红酸在280nm,喹啉黄在410nm,碱性蓝26在595nm处有良好的紫外吸收;而在这3个波长下均不能实现上述3种物质的同时检测测定。因此,为实现最佳检测,色谱检测波长应随出峰的情况进行调整。本方法中色谱检测胭脂虫红酸的检测波长分别设定为280、410和595nm。2.2流动相条件的优化本研究考察了同时分析检测胭脂虫红酸、喹啉黄、碱性蓝263种禁限用色素。由于这3种物质在化学性质上存在较大的差异,要实现同时分析存在一些困难。胭脂虫红酸是一种蒽醌类色素,喹啉黄为偶氮类合成色素,而碱性蓝26为脂溶性较强的物质。当流动相采用甲醇-水体系时,我们发现碱性蓝26很难从C18柱上洗脱下来,为此我们选择了乙腈-水体系。与此同时,我们还发现pH对3种物质的分离都有很大的影响,特别是对胭脂虫红酸和喹啉黄。实验结果表明,在碱性条件下很难将胭脂虫红酸和碱性蓝26从C18柱上洗脱下来,而酸性条件和高有机相组成条件下3种物质均能从柱上洗脱下来。因此,我们选择甲酸水溶液-乙腈体系考察对上述3种物质的分离情况,以获得同时检测上述3种物质的最佳分离条件。首先考察了pH的影响,将流动相中的水相加入0.1%甲酸,用氨水调节溶液的pH分别为2.0和4.0,而流动相中乙腈的比例均在20min内从10%线性增加至90%。当pH2时,胭脂虫红酸和喹啉黄无法达到基线分离;当pH4时,胭脂虫红酸和喹啉黄可以实现基线分离。此外,酸性条件下pH的微调对碱性蓝26在柱上的保留影响不大。随后,我们优化了乙腈的比例,实验结果表明在该流动体系里,流动相中乙腈的比例线性增加至30%~35%时胭脂虫红酸和喹啉黄可被洗脱下来,乙腈的比例线性增加至70%~85%时碱性蓝26可被洗脱下来。综上所述,我们是通过调整流动相的pH来实现胭脂虫红酸和喹啉黄的分离,而通过调整流动相中的乙腈比例来实现碱性蓝26与其他两种物质的分离。此外,我们根据上述3种物质的分离情况来调整检测波长。280nm用以检测胭脂虫红酸;当胭脂虫红酸完全出峰后,调整检测波长为410nm用以检测喹啉黄;随后调整检测波长为595nm以实现碱性蓝26的分析检测。这种波长的调整不需要高端的二极管阵列检测器就可以实现,现在市面上的一些国产液相色谱仪和岛津紫外可见双波长检测器SPD-20A就可以通过设定操作程序来实现不同时间段不同的检测波长。图1是上述3种色素的同时分离分析的色谱图。2.3标准工作曲线的绘制在上述色谱条件下,我们考察了胭脂虫红酸、喹啉黄和碱性蓝263种物质的检测情况。将色素储备液用超纯水分别稀释,并配制其浓度分别为100、50、10、5、1、0.1μg/mL的标准溶液。用0.22μm滤膜过滤后进液相色谱分析,所得色谱峰的浓度和对应的峰面积绘制标准工作曲线。结果表明这3种物质的浓度与其峰面积在一定范围内呈良好的线性关系。工作曲线和检测下限见表2。2.4洗脱和洗脱条件棒冰样品中含有的果胶,不易溶于水的着色剂等,为避免对HPLC部分的实验造成影响,同时也为了对目标检测物进行富集;本实验在样品离心结束后进行SPE小柱净化。先采用C18SPE小柱时,发现由于洗涤液等溶液为水相,常压下流速较慢,不利于被分析物的快速洗脱;因此,我们考查了聚酰胺小柱的净化情况。首先,上样前使用3mL甲醇、3mL水和3mL2%甲酸依次加入对小柱进行活化。使得小柱填充物在上样前的pH保持在1~2左右。上样后用双蒸水清洗后,便可以洗脱被分析物。洗脱液为氨水-甲醇溶液(V(氨水)∶V(甲醇)=1∶9)。为了找到甲醇洗脱液的合适浓度,分别考查了用80%、85%、90%、100%浓度的甲醇溶液进行洗脱的情况。发现虽然可以洗脱下胭脂虫红酸和喹啉黄,但这些溶液很难洗脱下碱性蓝26。因此,我们考虑提高洗脱液中的氨水浓度,但仍旧未能将碱性蓝26洗脱。这可能是因为甲醇的洗脱能力不足所致,因此改变甲醇为乙腈,结果表明纯乙腈可将碱性蓝26冲洗下来。所以,我们的洗脱条件为:先采用10%氨水甲醇溶液洗脱前两种物质,随后用纯乙腈洗脱碱性蓝26,这样的洗脱程序可使柱上基本无残留,填充物变为之前的白色。而后收集洗脱液由于其中的溶剂成分较复杂,有氨水、甲醇、乙腈以及可能含有的甲酸等成分,因此决定用氮吹器在40℃水浴下将洗脱液吹干,而后取3mL甲醇水溶液(V(甲醇)∶V(水)=9∶1)进行复溶。最终实验结果表明聚酰胺SPE小柱,回收率较高,可以实现棒冰样品的处理。2.5实际样本的检测将实际样品进行加标测定方法的回收率。每次测定3次,可以确定方法的精密度。实验的结果表明,该方法测定胭脂虫红酸、喹啉黄和碱性蓝26的回收率在90%~98%(如表3所示);平行6次进样,胭脂虫红酸的峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.56%,喹啉黄为0.5%,碱性蓝26为3.7%,精密度较好。本文中以奇彩炫棒冰为实际样本,考察了上述色素的检测情况。根据配料表该棒冰添加了胭脂虫红色素,但未使用喹啉黄和碱性蓝26。而我们的色谱分析后计算可知,该棒冰添加了胭脂虫红色素,其添加量为0.14μg/g(以胭脂虫红酸计),其他两种色素未检出,这一添加水平是符合国家标准的规定。实际样品及加标样本的谱图见图2,分析结果见表3。3精密度、准确度本文采用高效液相色谱法检测棒冰样品中的胭脂虫红酸、喹啉黄和碱性蓝26,线性范围分别为0.4~100μg/mL,0.4~100μg/mL以及0.3~50μg/mL检测下限分别为0.2、0.2、0.1μg/mL。方法的回收率为90%~98%,峰面积RSD为0.5%~3.7%,说明该方法准确可靠,精密度较好。此外