生物化学实验设计

PAGE成都医学院大学生设计性实验项目立题报告书课题名称研究胰岛B细胞不同程度损失糖尿病的表现研究方向生物化学专业、班级09级临床医学6班学生姓名俞昇（0925100257）徐丽（0925100258）刘晓梅（0925100259）导师姓名宋海星实验室名称生物技术实验室论证日期二0一一年一月十日说明一、开放性实验开题论证报告，是审核该课题是否符合科学性、可行性的要求及学生培养计划，保证实验项目顺利进行的有力措施，也是对学生实验思维的考核。学生在正式开题前都必须认真作好开题论证报告。二、开放性实验项目开题论证报告，一般要邀请与本课题研究内容关系密切的相关学科教师3～5名及部（系、院）主管部门领导参加。报告会由承担项目的实验室负责人主持，指导教师参加。三、经严格论证，对于选题合适，方法得当的可批准开题，对于尚有不足，必须按要求修改补充，必要时重新作论证报告。四、开题论证报告书中各项内容，都要实事求是，逐条认真填写。表达要准确。措词要简练，字迹要清楚易辨。实验名称：研究胰岛B细胞不同程度损伤糖尿病的表现实验设计的目的意义：目的与意义:至今无有效措施治疗糖尿病，使糖尿病病人的血糖长期保持稳定，此实验观察胰岛B细胞不同程度损伤型糖尿病的表现，为今后更好地研究治疗糖尿病奠定基础。国内外研究现状：糖尿病是威胁人类健康的常见病，发病率为3%～5%，从20世纪初人类开始对糖尿病进行系统研究，1921年发现胰岛素，1929年初首次应用于临床即获良效，几十年来陆续研制出长效、中效、特慢胰岛素，近年又合成人胰岛素。与此同时，口服降血糖药研制也不断取得成果，继第一代磺脲类降血糖药问世以来，第二代产品不断推出，并很快应用于临床。为征服糖尿病，世界上许多国家把积极开展糖尿病的防治作为国策。在我国郑州，河南康复中心医院成立了第一家专门教授糖尿病患者预防保健知识，融医疗、教育、科研于一体的糖尿病医疗研究中心，这就标志着我国医学界开始把糖尿病作为重大社会公共卫生问题。链脲佐菌素（STZ）为一种广谱抗菌素,具有抗菌、抗肿瘤的性能和致糖尿病的副作用,对实验动物的胰岛B细胞具有高度选择性的毒性作用[1]。STZ诱导的糖尿病因给药方式、剂量不同,其成模效果也有所差别。1985年赵凌云等使用一次性腹腔注射50mg/kgSTZ建立了速发型大鼠糖尿病模型；沈亚非等通过实验表明腹腔注射与尾静脉注射两种途径在诱导实验性糖尿病动物模型无显著差异。解决问题的思路：用不同量的链脲佐菌素腹腔内注射大鼠复制不同程度造成胰岛B细胞损伤的糖尿病动物模型，观察大鼠的表现,以及研究其特点二、实验研究方案（一）研究内容采用免疫印迹法检测以下指标：①比较注射链脲佐菌素和未注射链脲佐菌素的大鼠的表现及体内胰岛素的含量②比较注射不同浓度的链脲佐菌素的大鼠的表现及体内胰岛素的含量拟解决的关键问题：不同量的链脲佐菌素腹腔内注射大鼠造成胰岛B细胞不同程度损伤的糖尿病动物模型的制备，对模型进行分组与实验结果分析。研究方法免疫印迹法(1)免疫印迹法原理与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。(2)分组：选正常成年健康体重相近的大鼠200只，分为A,B,C,D三组，每组５０只A：对照B：每只大鼠腹腔注射链脲佐菌素50mg/kg一次C：每只大鼠腹腔注射链脲佐菌素70mg/kg一次D,每只大鼠腹腔注射链脲佐菌素90mg/kg一次一定时间后观察大鼠的表现以及用免疫印迹法检测大鼠的血液(三)技术路线及实验方案胰岛素抗体制备分组电泳免疫反应注射转移实验步骤：（1）分组：选正常成年健康体重相近的大鼠200只，分为A,B,C,D三组，每组５０只A：对照B：每只大鼠腹腔注射链脲佐菌素50mg/kg一次C：每只大鼠腹腔注射链脲佐菌素70mg/kg一次D,每只大鼠腹腔注射链脲佐菌素90mg/kg一次一定时间后观察大鼠的表现以及用免疫印迹法检测大鼠的血液（2）胰岛素样品获得：大鼠细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。（3）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS（4）转移：（半干式转移）1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。（5）免疫反应：1、用0.01MPBS洗膜，5min×3次。2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。3、弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。4、加入一抗（按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。5、弃一抗和1%BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01MPBS稀释），平稳摇动，室温2hr。7、弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。（6）分析数据：比较各组大鼠体内胰岛素的含量。（四）预期效果各组大鼠在注射链脲佐菌素前尿糖为阴性,注射48ｈ后，A组大鼠的胰岛素含量正常，血糖几乎没变,表现正常，而B组在注射链脲佐菌素后48ｈ胰岛素含量减少，血糖值升高,全身虚弱无力，劳动能力减退，精神萎靡不振，C组在注射链脲佐菌素后48ｈ胰岛素含量比Ｂ组少，血糖值比B组平均高出很多,症状比B组严重，以后血糖值持续在这一水平。D组在注射链脲佐菌素后48ｈ胰岛素含量最少，血糖值最高,症状最严重，以后血糖值持续在这一水平所需实验材料与仪器1、仪器设备情况：注射器、离心机、离心管，电泳仪,试管2、实验动物来源:从具有相应质量合格证的实验动物供应单位订购所需要的实验动物90只3、药品试剂来源：１．STZ溶解于0.1M的柠檬酸缓冲液中,PH4.2-4.5现配现用0.1~0.2ml/100g２、SDS试剂，一抗，二抗３、匀浆缓冲液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。５、0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。７、显色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H2021.0μl。(四)参考文献：【1】杨华章，陈亮.糖尿病的现状与进展.实用医学杂志.20042011２．【2】徐振兴林细池姚桂华邱明山免疫印迹法检测糖尿病患者血清自身抗体的方法学评价实验与检验医学２００８２６２３．【3】李徽徽柴继侠周艳梅链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病肾病模型的建立及肾脏病理结构改变蚌埠医学院学报２０１０１７PAGE指导教师审核意见