第六章 原核细胞基因工程

第六章原核细胞基因工程第六章原核细胞基因工程在基因工程中，目的基因的异源表达主要包括三个要素目的蛋白的DNA编码序列、表达载体、表达宿主(受体细胞或受体菌)。目的基因表达要素目的基因载体宿主需要表达的DNA序列运送外源基因进入受体细胞表达目的基因的细胞（原核或真核）在基因工程中，目的基因的异源表达主要包括三个要素目的蛋白的DNA编码序列、表达载体、表达宿主(受体细胞或受体菌)。其中，利用原核细胞作为表达宿主进行目的基因重组表达被称为原核表达，相应的基因工程技术被称为原核细胞基因工程。①原核生物大多数为单细胞异养生物，具有生长快、代谢易于控制的特点，可通过发酵迅速获得大量的基因表达产物。②原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)，识别原核基因的启动子，催化所有RNA的合成。③因为原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，二者也是连续进行的；而且在翻译过程中，mRNA可与多个核糖体结合形成多核糖体(polyribosome)，即在一条mRNA链上可以有多个核糖体同时进行合成反应，大大提高了翻译效率。与真核表达系统相比，原核表达系统具有以下优点。本章内容第一节原核表达系统的种类第二节原核表达策略第三节基因工程菌的大规模培养第四节原核表达产物的分离纯化第五节基因工程菌不稳定性及对策第六节原核表达应用举例第一节

原核表达系统的种类一个完整的表达系统主要包括表达载体和受体菌株。其中，表达载体是将目的基因导入宿主细胞，并在宿主中实现目的基因表达的运输工具。原核细胞表达载体的主体部分主要来自于相应宿主菌株的内源质粒，以此为基础添加与克隆表达相关的元件，即构成完整表达载体。原核表达载体除具有克隆载体所具有的复制起始位点、抗性选择标记等以外，还带有原核细胞所需要的表达元件，例如启动子、多克隆位点、终止子和SD序列，有时还包括融合标签的DNA编码序列等。优点：它的遗传背景清晰，基因工程操作手段完善；代谢途径和基因表达调控机制比较清楚；已有大量可供选用的大肠杆菌表达载体；它的培养成本低廉，生长繁殖迅速，

抗污染能力强，适合于大规模培养；外源基因产物的表达量高，目的蛋白可以占细菌总蛋白的30%以上，因此是目前应用最为广泛的原核表达系统。一.大肠杆菌表达系统缺点：目的蛋白常形成包涵体，导致后期纯化过程繁琐，应用成本高；由于原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，所以在表达某些真核基因时，会导致表达产物无法正确折叠或进行糖基化、磷酸化修饰，致使产物的生物活性相对较低。大肠杆菌内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定；大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。一.大肠杆菌表达系统常用的外源基因表达的载体有：pET系统、pBV等。一.大肠杆菌表达系统受体菌株有：BL21（DE3）、JM109等。1.BL21(DE3)该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。2.BL21(DE3)pLysS该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。一.大肠杆菌表达系统受体菌株有：BL21（DE3）、JM109等。3.Rosetta(DE3)pLysS

Rosetta菌株是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。一.大肠杆菌表达系统一.大肠杆菌表达系统受体菌株有：BL21（DE3）、JM109等。3.Rosetta(DE3)pLysS

Rosetta菌株是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。4.JM109

该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性。芽孢杆菌为革兰阳性细菌，细胞壁不含内毒素，能分泌大量蛋白质到体外，为一些重要工业酶制剂的生产菌种，能形成芽孢，而子囊中只有一个芽孢。除个别种如炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)和蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)外，其他芽孢杆菌对人畜无毒。二.芽孢杆菌表达系统优点：①芽孢杆菌是非致病微生物，比较安全；②培养条件简单，易于控制；③生长迅速，周期短；④表达产物能分泌到细胞外的培养基中；⑤多数表达产物具有天然构象和生物学活性；⑥某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，且利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。二.芽孢杆菌表达系统缺点：野生型芽孢杆菌能分泌大量的胞外蛋白酶，影响外源基因表达产物的稳定性。

因此，在构建芽孢杆菌表达系统宿主菌时需要将蛋白酶基因进行突变或敲除，使其降低活性甚至失活。遗传欠稳定，载体受体系统欠完备。二.芽孢杆菌表达系统二.芽孢杆菌表达系统应用：适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌。目前应用较多的芽孢杆菌宿主菌有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杄菌、淀粉芽孢杄菌、巨大芽孢杆菌、球形芽孢杄菌、短芽孢杄菌、嗜热脂肪芽孢杄菌、耐碱的芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等。

其中，枯草芽孢杆菌(又称枯草杆菌，Bacillussubtilis)表达系统是目前应用最为广泛的，枯草芽孢杆菌是一种重要的工业微生物，人们对其遗传背景和生理学特性的了解仅次于大肠杆菌。链霉菌是一类革兰阳性细菌，广泛分布于土壤中，能产生多种生理活性物质。三.链霉菌表达系统优点：①链霉菌为非致病菌，使用比较安全；②不产生内毒素；③表达产物可分泌到细胞外；④可进行高密度培养；⑤具有丰富的次生代谢途径和初级、次生代谢调控系统；⑥链霉菌进行工业规模化发酵的技术成熟。缺点：遗传不稳定，生长相对缓慢。三.链霉菌表达系统应用：链霉菌受体系统中常用的宿主菌有变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌。天蓝色链霉菌有很强的修饰系统，因此在实际应用中均以变铅青链霉菌作为外源基因表达的表达系统。变铅青链霉菌表达系统：大肠杆菌的卡那霉素抗性基因(Kan)、牛生长激素基因、人白细胞介素2基因、人乙肝表面抗原(HBsAg)基因、人类干扰素(IFN-a2、IFN-a1)基因、人类肿瘤坏死因子(TNF)基因等。三.链霉菌表达系统三.链霉菌表达系统1952年，美国微生物学家赛尔曼·A·瓦克斯曼（SelmanA.Waksman）因“发现链霉素——第一个有效对抗结核病的抗生素”获得了当年的诺贝尔生理医学奖。蓝藻又称蓝细菌，是一类能够进行植物型放氧光合作用的原核生物，有大约150个属，2000余种。蓝藻具有独特的细胞结构，多年来一直被广泛应用于光合作用、固氮作用和叶绿体起源等生物学问题的研究中。近年来，随着蓝藻分子生物学研究的深入，蓝藻也开始被作为表达外源目的基因的受体系统。四.蓝藻表达系统优点：①蓝藻遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测；②蓝藻是革兰阴性菌，细胞壁主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化；③光合自养型生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要，生产成本低；④多数蓝藻有内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了良好的条件；⑤蓝藻在各个生长时期均处于感受态，便于外源基因的转化；四.蓝藻表达系统优点：⑥多数蓝藻无毒，且富含蛋白质，早已用作食品或保健品，在此基础上开展转基因技术研究，将一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，可达到锦上添花的效果。四.蓝藻表达系统应用第二节

原核细胞表达策略①目的基因DNA片段的制备。目的基因可以从基因组中进行扩增，也可以通过人工合成的方法获得。值得注意的是，原核细胞中缺乏真核生物的转录后加工系统，因此目的基因不能用真核生物的基因组DNA，而应该用cDNA。②目的基因与表达载体的连接。表达载体中，在启动子区的下游设计有多克隆位点，目的基因的DNA片段通过这些位点插入到启动子的下游，受到相应启动子的调控。③将重组载体导入到宿主菌中，从而获得相应的基因工程菌株。一般的转化方法包括化学法、电转化等。外源基因在原核细胞中的表达主要包括以下步骤外源基因在原核细胞中的表达主要包括以下步骤④对重组菌株进行发酵培养，并在生长量达到一定水平后诱导目的基因的表达，根据启动子的类型，分为组成型表达和诱导型表达。⑤检测目的蛋白的表达量及活性，然后进行分离纯化。一.融合型表达将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，这样形成的蛋白质称为融合蛋白。外源蛋白以融合蛋白的方式表达时能以较高的效率进行，因为受体菌自身蛋白基因的SD序列和碱基组成等有利于基因的表达。常见的融合蛋白表达载体包括pRSET、pGEX系列等。一.融合型表达表达融合型蛋白时，为了得到正确的真核蛋白，在插入真核基因时，应非常注意其阅读框架，确保融合的各个DNA片段的阅读框架一致，只有这样，在翻译时才不至于产生移码突变。以融合形式表达目的蛋白的优缺点：目的蛋白稳定性高，尤其对分子量较小的多肽效果更佳。目的蛋白易于分离，利用受体蛋白建立相应抗体、配体、底物亲和层析系统，可以快速获得纯度较高的融合蛋白。目的蛋白表达率高，与受体蛋白共用一套完善的表达元件。目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。目的蛋白需要回收，融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段。一.融合型表达融合蛋白表达质粒的构建原则：受体细胞的结构基因要能高效表达，其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。外源基因应在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件。两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺。两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。一.融合型表达用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱甘肽转移酶（GST）维持良好空间构象麦芽糖结合蛋白（MBP）促进分泌金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫亲和层析pRIT2T硫氧化还原蛋白（TrxA）维持良好空间构象pTrxFus外膜蛋白（OmpF）促进分泌

-半乳糖苷酶（LacZ）免疫亲和层析泛素蛋白（Ubi）维持良好空间构象一.融合型表达目的蛋白的回收：一.融合型表达融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：化学断裂法和酶促裂解法。化学断裂法：一.融合型表达用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（CNBr），它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收率高（可达到85%以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。化学断裂法：一.融合型表达如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。一.融合型表达蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，同时每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定簇，因此可供选择的专一性断裂位点范围较广。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中的精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。

酶促裂解法：单残基位点蛋白内切酶切割位点梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假单孢菌蛋白酶Lys-C猪胰蛋白酶Arg-CArgCNNC受体蛋白目的蛋白酶促裂解法：单残基位点一.融合型表达

蛋白酶裂解融合蛋白的前提条件是外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸，如果外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条件并不苛刻，但大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的。酶促裂解法：多残基位点一.融合型表达为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。

纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物。目的蛋白的回收ATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCXa-1ATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaIXa因子切割位点IleGluGlyArgGlu酶促裂解法：多残基位点Xa因子识别位点编码序列生物素结合肽编码序列SP6T7AproritacMCSPinpointXa启动子受体基因GST接头目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-Arg表达亲和层析酶解回收谷胱甘肽转移酶（GST）谷胱甘肽酶促裂解法：多残基位点二.非融合型表达不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白。非融合蛋白的优点在于它具有非常近似于真核生物体内蛋白质的结构，因此表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。二.非融合型表达非融合蛋白的最大缺点是容易被细菌蛋白酶破坏。为了在原核细胞中表达出非融合蛋白，可将带有起始密码ATG的真核基因插到原核启动子与SD序列的下游，组成一个杂合的核糖体结合区，经转录翻译，得到非融合蛋白。不易分离纯化。三.分泌型表达大肠杆菌中某些蛋白质属于分泌型蛋白质，可以被分泌到细胞膜外的间质中，这是由于在这些蛋白质的N端存在着一段称为信号肽(signalpeptide)的多肽。在信号肽的帮助下，蛋白质可以跨过细胞膜而分泌到胞外。蛋白质的分泌机制原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感。三.分泌型表达大肠杆菌中某些蛋白质属于分泌型蛋白质，可以被分泌到细胞膜外的间质中，这是由于在这些蛋白质的N端存在着一段称为信号肽(signalpeptide)的多肽。在信号肽的帮助下，蛋白质可以跨过细胞膜而分泌到胞外。因此，将编码信号肽的DNA序列插入到载体的启动子与目的基因之间，就可使目的基因编码的蛋白质分泌到胞外，减少了细菌蛋白酶的破坏，同时为表达产物的分离纯化等提供了极大的方便。三.分泌型表达常用的分泌型表达载体包括pINⅢ、plN-ompA等系列。三.分泌型表达优点：简化了发酵后处理的纯化工艺；减少了外源蛋白在细胞内被蛋白酶降解的概率；通过对分泌表达的设计有利于形成正确的空间构象，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。三.分泌型表达缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。四.多拷贝表达外源基因在细胞中的表达水平与目的基因的拷贝数相关。研究表明，当表达载体上外源基因的拷贝数增加时，可将外源蛋白的表达量相应提高。表达载体上可表达的基因包括外源基因和选择标记基因等，当细胞内质粒表达载体的拷贝数增加时，用于合成目的蛋白之外的其他蛋白质的量也相应增加，而过多地表达非目的基因消耗大量能量，影响菌株的生长代谢。因而在构建外源蛋白表达载体时，可以考虑将多个外源蛋白基因串联在一起，克隆在严谨型质粒载体上。四.多拷贝表达以这种策略表达外源蛋白时，虽然宿主细胞内质粒的拷贝数减少，但外源基因在细胞内转录的mRNA的拷贝数并不减少。这种方法对分子量较小的外源蛋白更为有效。四.多拷贝表达外源基因多分子线性重组的方式通常有三种：一是多表达单元的重组，即每个表达单元都含有独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码，形成独立转录与串联翻译的表达单元，表达单元之间的连接方向与表达效率无关。表达的外源蛋白不须经过裂解处理。这种方式适合于表达分子量较大的蛋白质。典型的编码蛋白质的原核基因结构示意图四.多拷贝表达外源基因多分子线性重组的方式通常有三种：一是多表达单元的重组，即每个表达单元都含有独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码，形成独立转录与串联翻译的表达单元，表达单元之间的连接方向与表达效率无关。表达的外源蛋白不须经过裂解处理。这种方式适合于表达分子量较大的蛋白质。二是多顺反子重组，即多拷贝外源基因有各自的SD序列、翻译起始和终止信号，但这些基因的转录使用共同的转录启动子和终止子，表达的外源蛋白分子仍是相互独立的，这种方式对表达中等大小分子量的外源蛋白比较合适。四.多拷贝表达外源基因多分子线性重组的方式通常有三种：三是多编码序列重组，即将多个外源基因串联在一起，利用同一套转录调控元件和翻译起始与终止密码子，在各自编码序列的连接处引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点，这种方式适合表达外源小分子量蛋白质或多肽。五.整合型表达将一种重组质粒导入受体细胞后，宿主细胞的代谢会发生较大改变，同时由于细胞不断地进行分裂，经若干次传代后宿主细胞内的重组质粒会发生丢失。因此，一种理想的选择是将要表达的外源基因整合到宿主菌的染色体的特定位置上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传和表达。五.整合型表达优点：目的基因表达稳定整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，在大多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程案例特别有意义。缺点：目的基因表达率低单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达元件而加以补偿。在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着DNA的遗传重组机制，其可能的生物学功效是促进生物种群的进化。细胞内的遗传重组可分为两大类：DNA体内重组的基本原理（1）转位因子依赖型（2）同源序列依赖型转位因子是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子，例如：转位因子依赖型的体内重组：转位因子家族DNA体内重组的基本原理噬菌体

G片段（G-Fragment）真核细菌 转座子（Tn、Ty）原核细菌 插入顺序（IS）高等植物

可移动因子（Ac、Ds）高等动物 跳跃基因（mobilgene）转位因子依赖型的体内重组：转位因子的结构IS（1kb）Ty（5kb）Tn（2-20kb）ACCATGGTTTTGGTACCA抗药性基因转位酶基因识别位点阻遏基因IRIRIRIRISISDNA体内重组的基本原理在很多原核细菌细胞中，染色体DNA链上的两个同源区之间可发生所谓的同源重组，其频率与细菌种类、两个同源区之间的距离同源区的长度、同源程度密切相关。一般地说，距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者涉及两个断裂位点。（2）同源序列依赖型的体内重组：基本形式DNA体内重组的基本原理（2）同源序列依赖型：同源交换DNA体内重组的基本原理染色体DNA同源区域标记基因ori目的基因整合位点（2）同源序列依赖型：同源交换DNA体内重组的基本原理ori同源区域交换区域染色体DNA目的基因标记基因ori+六.提高表达效率的方法1.启动子的选择2.核糖体结合位点3.选择强终止子4.提高表达载体的质粒拷贝数和稳定性5.注意不同物种对密码子的偏好性1.启动子的选择原核基因的表达调控主要是在转录水平，以操纵子为单位，因此启动子的正确选择是实现目标蛋白高表达的关键步骤之一。原核生物的启动子一般由四部分构成：①转录起始位点；②Pribnowbox(也称-10区)；③Sextama框(也称-35区)；④间隔区。①作用要强，待表达的基因产物要占有或超过菌体总蛋白的10%~30%；②必须表现最低水平的基础转录活性，最好选用高密度培养细胞和表现最低基础转录活性的可诱导或非抑制启动子，以减少合成的外源蛋白对宿主细胞的毒害作用或对其生长的限制作用；③启动子具有简便和廉价的可诱导性。1.启动子的选择能在原核表达系统中应用的启动子很多，为了提高表达水平，这些启动子必须具有以下特性：目前，在大肠杆菌表达系统中最常用的是来自于大肠杆菌噬菌体的T7启动子、lac启动子(乳糖启动子)、trp启动子(色氨酸启动子)、λ噬菌体PL启动子(λ噬菌体的左向启动子)以及tac启动子(乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。1.启动子的选择启动子具有如下特征：(1)序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常含有几个保守序列框，序列框中碱基的变化会导致转录启动的滞后和转录速度的减慢。(2)方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件，在正反两种方向中只有一种具有启动功能。(3)位置特异性。启动子只能位于所启动转录基因的上游或者基因内的前端，处于基因的下游或在基因的上游但远离所要启动的基因，则一般不会有作用。1.启动子的选择启动子具有如下特征：(4)种属特异性原核生物的不同种、属，真核生物的不同组织都具有不同类型的启动子。但一般来说，亲缘关系越近的两种生物，其启动子通用的可能性也越大。1.启动子的选择启动子的构建启动子-35区序列-10区序列PlLPrecAPtraAPlacPtacTTGACATTGATATAGACATTTACATTGACATATAATTATAATTAATGTTATAATGATACTPtrpTTGACATTAACTEEAEE启动子最佳距离的探测目的基因A酶切开目的基因启动子Bal31酶解野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高启动子的可控性（lac启动子）乳糖启动子Plac的可控性：基底水平转录阻遏蛋白乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导高效转录POPO野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAMP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5乳糖启动子Plac的可控性：cAMPCAP高效转录基底水平转录cAMP浓度降低葡萄糖代谢高效转录PlacPlacPlacUV5OOO启动子的可控性（lac启动子）色氨酸启动子Ptrp的可控性：色氨酸启动子Ptrp受是大肠杆菌的色氨酸操纵子的启动子，在色氨酸操纵子的调控中，细胞中色氨酸的浓度是重要的调控因素，B-吲哚丙烯酸是色氨酸的竞争抑制剂，它能与阻遏蛋白结合，阻止色氨酸与阻遏蛋白的结合，是一种转录促进剂。如果删除了衰减子则可使转录效率提高8~10倍。色氨酸基底水平转录阻遏蛋白除去色氨酸PtrpOtrp或加3-吲哚丙烯酸（IAA）高效转录高效转录PtrpOtrpPtrpOtrp启动子的可控性（trp启动子）启动子的构建启动子-35区序列-10区序列PlLPrecAPtraAPlacPtacTTGACATTGATATAGACATTTACATTGACATATAATTATAATTAATGTTATAATGATACTPtrpTTGACATTAACTtac启动子亦称为trp-lac启动子，是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子。tac启动子受乳糖操纵子的阻遏蛋白的负调控，当存在有高水平的lac阻遏蛋白时，tac启动子受到抑制，如加入IPTG后，可使tac启动子去阻遏并诱导其表达。启动子的可控性（tac启动子）PL和PR启动子分别是λ噬菌体基因组上的左向和右向启动子，它们都是强启动子，比lac启动子的活性高8~10倍。

PL和PR启动子受λ噬菌体cI基因产物的负调控。cI基因产物是温度敏感蛋白，是PL和PR启动子转录的阻遏蛋白。在较低温度(28~32℃)培养时，cI基因产物产生抑制作用，在温度升至42℃时，其被破坏，于是PL和PR启动子开始转录。在构建带有PL和PR启动子表达载体时，需将cI基因组装在表达载体上，或选择溶源化入噬菌体的大肠杆菌作为该表达载体的宿主菌，如N99cI+菌株。启动子的可控性（PL和PR启动子）T7噬菌体启动子是目前最常用的启动子，如Invitrogen公司的pET系列就是采用的该启动子。在该系统中，目的基因的转录完全依赖于T7噬菌体RNA聚合酶，所以在构建带有T7噬菌体启动子表达载体时，需要配合使用能表达T7噬菌体RNA聚合酶的受体菌，这些菌株是被噬菌体溶源化的，如JM109(DE3)、BL21(DE3)、HMS174(DE3)等。启动子的可控性（T7噬菌体启动子）六.提高表达效率的方法1.启动子的选择2.核糖体结合位点3.选择强终止子4.提高表达载体的质粒拷贝数和稳定性5.注意不同物种对密码子的偏好性2.核糖体结合位点mRNA在细菌中的翻译效率严格依赖于是否有核糖体结合位点的存在，这是因为细菌在翻译水平上的调控是不严格的，只有mRNA和核糖体的结合，才是蛋白质合成的关键。核糖体结合位点(ribosome-bindingsite，RBS)是指紧靠启动子下游的，从转录起始位点开始延伸几十个碱基长度的一段序列，翻译起始密码子AUG通常位于它的中心位置，是核糖体RNA识别与结合的位点。2.核糖体结合位点在原核生物中，RBS又被称为SD序列，是位于起始密码子AUG上游3~10bp处、由3~9bp组成的一致性序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16sRNA3-末端的富含嘧啶核苷酸的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列(AAGGA或UAAGGAGG)与起始密码子(AUG)的间距对翻译起始效率影响较大。当lac启动子的SD序列距ATG为7个核苷酸时，目的基因的表达最高，而间隔8个核苷酸时，表达水平下降500倍。mRNA与rRNA的互补区域越长，基因翻译的概率就越大。SD序列与起始密码子之间的碱基组成也影响翻译的起始效率。SD序列所在的翻译起始区应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始效率。六.提高表达效率的方法1.启动子的选择2.核糖体结合位点3.选择强终止子4.提高表达载体的质粒拷贝数和稳定性5.注意不同物种对密码子的偏好性3.选择强终止子在基因的3′-末端或一个操纵子的3′-末端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子或简称终止子。终止子是表达载体中必不可少的元件，既可避免高水平转录对高拷贝质粒稳定性的影响，又可使转录出的mRNA尽可能短，以提高mRNA的稳定性，从而提高蛋白质的表达水平。依据转录终止机理的不同，原核生物的转录终止子可以分为两类：依赖于

因子的终止子(弱终止子)和不依赖于

因子的终止子(强终止子)。3.选择强终止子在构建表达载体时，一般使用强终止子终止外源基因的表达。六.提高表达效率的方法1.启动子的选择2.核糖体结合位点3.选择强终止子4.提高表达载体的质粒拷贝数和稳定性5.注意不同物种对密码子的偏好性4.提高表达载体的质粒拷贝数和稳定性强化外源基因在原核宿主菌中高效表达的中心环节是提高mRNA的数量。这可通过两种途径来实现：一是用强启动子以提高转录效率；二是将外源基因克隆在高拷贝的表达载体上。质粒分子过量增殖消耗大量能量，影响受体细胞的生长和代谢，进而导致质粒的不稳定以及外源基因宏观表达水平的降低。解决这一问题的一种有效策略是在表达载体中采用可调控的诱导型复制子来控制质粒的增殖。例如，pCP3表达质粒的复制子来源于温度敏感型质粒pKN402，可受温度诱导。质粒扩增时序的控制pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子。在28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60；在42℃时，拷贝数迅速增至300–600，在此温度下，受体细胞染色体上的CI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活。因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表达pCP3MCSPLAproriVectorsCopyNumberoripUC~500-700pMB1(derivative)pBR322~15-20pMB1pET~15-20pBR322pGEX~15-20pBR322pColE1~15-20ColE1pR6K~15-20R6KpACYC~10p15ApSC101~5pSC101pBluescript~300-500ColE1(derivative)andF1pGEM~300-500pUCandF1常见质粒载体拷贝数及其复制子表7-1原核表达载体上的常用复制子受体菌复制子大肠杆菌pMBIp15ApColE1pSC101芽孢杆菌pUB110pC194pE194pHY481pWT481链霉菌pIJ101SCP2pIJ702pIJ61pIJ699pKC796蓝藻pPbspPKE2pUC104pSG111六.提高表达效率的方法1.启动子的选择2.核糖体结合位点3.选择强终止子4.提高表达载体的质粒拷贝数和稳定性5.注意不同物种对密码子的偏好性5.注意不同物种对密码子的偏好性由于遗传密码的简并性(degeneracy)，除个别氨基酸(色氨酸和甲硫氨酸)外，大多数氨基酸都具有两个或者两个以上的密码子。这种编码相同氨基酸的一组密码子称为同义密码子(synonymcodon)。5.注意不同物种对密码子的偏好性由于遗传密码的简并性(degeneracy)，除个别氨基酸(色氨酸和甲硫氨酸)外，大多数氨基酸都具有两个或者两个以上的密码子。这种编码相同氨基酸的一组密码子称为同义密码子(synonymcodon)。通过对大肠杆菌各种基因序列的大量分析表明，同义密码子在基因中出现的频率并不一样，即密码子使用存在差异的现象，这种现象同样存在于真核生物中，称为密码子偏好或密码子偏爱(codonpreference)。5.注意不同物种对密码子的偏好性研究者对大肠杆菌中的密码子使用频率进行系统分析得到以下结论：①大多数简并密码子中的一个或两个具有偏好；②某些密码子对所有不同的基因都是常用的，如CCG是脯氨酸最常用的密码子；③表达强度高的基因比表达强度低的基因表现更大程度的密码子偏好性；④同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量呈高度相关。5.注意不同物种对密码子的偏好性不同生物甚至同种生物的不同蛋白质的基因对简并密码子的使用有一定的选择性。一般来说稀有密码子含量较高(或稀有密码子连续岀现)的外源基因，在翻译过程中容易发生提前终止或移码突变或翻译速率变慢。可采取下列措施：

①在受体菌中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高受体菌中稀有密码子tRNA的丰度；

②在不改变外源基因编码蛋白的一级结构的前提下，可通过突变或者基因重新合成方法将外源基因中的稀有密码子改为受体菌中的偏爱密码子。密码子优化密码子优化技术，使得优化后的proteinα表达水平相比未优化的序列提高了10倍。5.注意不同物种对密码子的偏好性外源基因全合成。

按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法。本章内容第一节原核表达系统的种类第二节原核表达策略第三节基因工程菌的大规模培养第四节原核表达产物的分离纯化第五节基因工程菌不稳定性及对策第六节原核表达应用举例第四节

原核表达产物的分离纯化传统发酵产品和基因工程产品提取精制的差异差异项目传统发酵基因工程发酵产品分子量一般为小分子，对产品结构分析比较透彻大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验表达物细胞内定位细胞内外都有一般位于细胞内表达量表达量低表达量高提取方法简单复杂一、分离纯化的目标与策略利用转基因工程菌株表达外源基因所获得的目标蛋白的分离和纯化，一般包括两大步骤：一是初步分离获得初提物，这一过程具体包括细胞破碎、蛋白类物质的分离以及对特异表达蛋白的沉淀和超滤浓缩等；二是对初提物进行进一步提纯，提高其品质，这一过程所采用的手段包括色谱和电泳等。分离纯化的目标分离纯化的目标：将重组蛋白质从杂质蛋白质、核酸、脂类、糖类以及其他代谢产物和培养基成分中分离出来。分离产物所需达到的目标与产物的用途有关。如果分离纯化的蛋白质只是用作一般实验室研究使用，则一般不会过多地考虑作为基因工程药物所顾及的纯度和安全性，而且事实上也不会有纯度为100%的蛋白质。如果作为蛋白质晶体结构分析、序列测定或作为人体注射用药物，则纯度和安全性将是考虑的最重要的因素。对于生产者和客户来说，生产成本也是考虑的重要因素之一。(1)确定分离纯化策略时必须考虑的因素①表达系统的影响。基因工程表达系统的影响包括工程菌的种类或细胞类型、代谢特征、表达方式(胞内、胞外、包含体)、表达产物和副产物种类、代谢物种类、产物类似物毒素和能降解表达产物的酶类等。第四章基因工程的载体第一节质粒载体第二节噬菌体载体第三节酵母载体第四节Ti质粒表达载体第五节病毒表达载体第六节人工染色体载体(1)确定分离纯化策略时必须考虑的因素①表达系统的影响。基因工程表达系统的影响包括工程菌的种类或细胞类型、代谢特征、表达方式(胞内、胞外、包含体)、表达产物和副产物种类、代谢物种类、产物类似物毒素和能降解表达产物的酶类等。②表达产物性质的影响。重组蛋白质本身的物理、化学与生物学特性，包括化学组成分子量、等电点、电荷分布和密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类和表面活性等都是分离纯化的重要依据，必须充分考虑。同时应该考虑到重组蛋白质都是具有生物活性的大分子。(1)确定分离纯化策略时必须考虑的因素③初始物料、杂质等因素的影响。由于使用的菌种不同，所需的原始物料及由此产生的杂质也有很大不同，这些因素都会对目的产物的分离纯化产生影响。④生产工艺、生产条件的影响。生产工艺包括生产方式(连续、分批、半连续)、生产周期、生产能力、工艺控制等，生产条件主要是指生产中的环境条件、卫生条件、无菌状态与灭菌方法等，这些因素也会影响产物的分离纯化。(2)制定合理的纯化方式和纯化工艺蛋白质纯化包含许多方法，包括沉淀、色谱、电泳、离心等各种分离方法，但如何将这些方法有机地结合起来，形成完整的工艺过程则是最为重要的环节。沉淀。硫酸铵或乙醇等进行沉淀可获得2~8倍纯化目标蛋白。沉淀硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常用的纯化和浓缩蛋白的技术。蛋白质的溶解度和盐浓度密切相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的结合蛋白表面的水分子，破坏蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。(2)制定合理的纯化方式和纯化工艺蛋白质纯化包含许多方法，包括沉淀、色谱、电泳、离心等各种分离方法，但如何将这些方法有机地结合起来，形成完整的工艺过程则是最为重要的环节。沉淀。硫酸铵或乙醇等进行沉淀可获得2~8倍纯化目标蛋白。超滤离心。超滤可分离相对分子质量在1,000~300,000间的蛋白质。(2)制定合理的纯化方式和纯化工艺蛋白质纯化包含许多方法，包括沉淀、色谱、电泳、离心等各种分离方法，但如何将这些方法有机地结合起来，形成完整的工艺过程则是最为重要的环节。沉淀。硫酸铵或乙醇等进行沉淀可获得2~8倍纯化目标蛋白。超滤离心。超滤可分离相对分子质量在1,000~300,000间的蛋白质。色谱。经过沉淀、超滤处理的样品常进一步进行柱色谱，以快速捕获蛋白质，尽可能减少蛋白质降解和其他修饰。(2)制定合理的纯化方式和纯化工艺融合标签。对于重组蛋白，一般已在其C端或N端连接上了一个融合标签，包括与底物或抑制剂亲和的全酶、与单克隆抗体结合的抗原表位、由IMAC复性的寡聚组氨酸、血凝素识别的碳水化合物结合蛋白或结合域、体内生物素化的生物素结合域等。利用这个标签可以进行亲和色谱纯化以获得目标蛋白。用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱甘肽转移酶（GST）维持良好空间构象麦芽糖结合蛋白（MBP）促进分泌金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫亲和层析pRIT2T硫氧化还原蛋白（TrxA）维持良好空间构象pTrxFus外膜蛋白（OmpF）促进分泌

-半乳糖苷酶（LacZ）免疫亲和层析泛素蛋白（Ubi）维持良好空间构象一.融合型表达(2)制定合理的纯化方式和纯化工艺融合标签。对于重组蛋白，一般已在其C端或N端连接上了一个融合标签，包括与底物或抑制剂亲和的全酶、与单克隆抗体结合的抗原表位、由IMAC复性的寡聚组氨酸、血凝素识别的碳水化合物结合蛋白或结合域、体内生物素化的生物素结合域等。利用这个标签可以进行亲和色谱纯化以获得目标蛋白。部分融合系统中标签蛋白可能会干扰目标蛋白的生物学活性和稳定性，可利用预先设计的特异性蛋白酶裂解位点切除标签蛋白。二、分离纯化的一般过程根据外源基因在宿主细胞中表达方式的差别以及表达蛋白本身的特性，重组蛋白的分离纯化工艺各不相同。一般都包括对发酵液进行预处理、回收菌体、细胞破碎、离心分离、样品的浓缩与预处理、柱色谱和电泳等步骤。在分离过程中，为保证蛋白质的生物活性，一般在低温条件下操作，提取的条件也要尽量保持温和。分离纯化方法的选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数和回收率。1.发酵液的预处理预处理有助于后面的操作过程，可以达到以下目的：改变发酵液的物理性提高固液分离效率；转移产物至后续处理的相中；除去部分杂质，简化后续工艺。发酵液的预处理内容主要包括改变发酵液物理性状(如加热、调节PH值、絮凝等)以及改善固液分离特性(通过过滤等方法实现固液分离)两类方法，根据被分离物质的性质可选择某一种或者其中的几种方法相结合使用。2.细胞分离(1)离心沉降法是利用固体颗粒在外力作用下与液体物质作相对运动最终实现固液分离的细胞分离技术。2.细胞分离(1)离心沉降法是利用固体颗粒在外力作用下与液体物质作相对运动最终实现固液分离的细胞分离技术。(2)过滤法主要利用多孔介质将固液悬液中的固相颗粒截留，液体则通过介质来实现分离。根据被分离物质的大小可以分为一般介质的过滤和膜过滤。3.细胞破碎对于在胞内表达的蛋白质，将细胞与液态相分离后，就要考虑将细胞破碎，以使目标蛋白质从胞内释放到提取液中，然后进行目的产物的纯化。常用的细胞破碎方法包括物理法、化学法和生物方法，破碎细胞壁和细胞膜，从而将胞内物质释放到提取液中。针对不同的细胞种类和细胞的不同生长状态，可选择适当的破碎方法。常见的破碎方法有变性剂裂解法、超声波破碎法、机械破碎法、酶解法和反复冻融法。3.细胞破碎(1)变性剂裂解法有的细胞如果没有坚硬的细胞壁，破碎条件可选择相对较温和的变性剂进行裂解。在破碎缓冲液中加入变性剂就可使细胞破裂。常用的变性剂包括盐酸胍、尿素、SDS、Nonidet-40(NP-40)、吐温等。(2)超声波破碎法这是实验室常用的一种细胞破碎方法。超声波法破碎细胞的一个明显缺点是在超声波处理过程中，会产生大量的热量，可能破坏蛋白质结构，所以应采取相应的降温措施。3.细胞破碎(3)机械破碎法该法利用外力作用将细胞破碎，最常用的就是研磨法，适合于细菌酵母和植物细胞的破碎。在研磨之前，一般加入石英砂或细玻璃珠与待破碎的细胞混合，以增大摩擦力，使细胞更容易硏碎。另外可以采取的一个措施是在硏磨前将待破碎细胞用液氮处理，在液氮中研磨既増加了细胞的脆性也提供了低温环境，保证了蛋白质活性。3.细胞破碎(3)机械破碎法该法利用外力作用将细胞破碎，最常用的就是研磨法，适合于细菌酵母和植物细胞的破碎。在研磨之前，一般加入石英砂或细玻璃珠与待破碎的细胞混合，以增大摩擦力，使细胞更容易硏碎。另外可以采取的一个措施是在硏磨前将待破碎细胞用液氮处理，在液氮中研磨既増加了细胞的脆性也提供了低温环境，保证了蛋白质活性。(4)酶解法该法主要参考组成细胞壁的物质分子特点，利用能降解细胞壁的酶将菌体细胞壁破坏，使细胞暴露在低渗溶液或者含变性剂的溶液中从而破裂。3.细胞破碎(5)反复冻融法该法利用生物组织经冰冻后，细胞内液结冰膨胀从而破坏细胞。具体操作方法是将细胞在-20℃以下冰冻，室温融解，反复几次后，大部分细胞都可被破碎。4.离心分离离心是基因表达产物分离纯化的重要步骤，包括高速离心和超速离心。高速离心的离心力一般在10000g的范围以内，主要用来去除未破碎的细胞和细胞壁碎片等。经过高速离心后细胞膜碎片和细胞内的可溶性蛋白等主要存在于上清液中。如果基因表达产物是小分子可溶性蛋白，还可以进行超速离心(10000以上)以除去细胞膜碎片等杂质。5.柱色谱根据蛋白质的不同用途，需要对表达的特异性蛋白质进行进一步的分离纯化，而柱色谱技术是蛋白质分离纯化的重要手段。色谱法(chromatography)包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱、吸附色谱、金属鏊合色谱以及共价色谱等。6.电泳电泳不仅是检测蛋白质的重要手段，在实验室也可以作为少量制备或纯化蛋白质的方法。蛋白质电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。PAGE可分为Native和SDS两种，前者主要用于不能变性的表达蛋白的分离与纯化，后者则用于可通过变性的方法作进一步纯化的特异性表达蛋白。三、包涵体的溶解和重组蛋白的复性在外源基因的原核表达中，尤其是以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集形成不溶性蛋白质晶状物，称为包涵体(inclusionbody)。三、包涵体的溶解和重组蛋白的复性在外源基因的原核表达中，尤其是以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集形成不溶性蛋白质晶状物，称为包涵体(inclusionbody)。包涵体是不具有膜结构的非晶体性蛋白质聚集体。在偏振光显微镜或电子显微镜下可发现包涵体与细胞质的明显区别。三、包涵体的溶解和重组蛋白的复性在外源基因的原核表达中，尤其是以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集形成不溶性蛋白质晶状物，称为包涵体(inclusionbody)。包涵体是不具有膜结构的非晶体性蛋白质聚集体。在偏振光显微镜或电子显微镜下可发现包涵体与细胞质的明显区别。目前上市的重组蛋